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高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法

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高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法

王慧娜初志戰(zhàn) 馬興亮李日清劉耀光^*

亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642

摘要：制備大量生物樣品的模板DNA用于PCR檢測(cè)是費(fèi)時(shí)費(fèi)人工的工作。本文介紹一種高通量的植物基因組DNA(gDNA)快速制備及其用于PCR基因型檢測(cè)的操作方法。將一小段單子葉植物苗葉片(長(zhǎng)度約30 mm或40 mm，與96方孔板的孔深大致相同) 或一小塊(約2~4 mg)雙子葉植物葉片放入96方孔板的各孔中、放入一粒鎢合金珠和150 µL制備緩沖液，蓋好硅橡膠蓋，在渦旋器振動(dòng)3~5 min破碎組織。用96針復(fù)制器(或多通道移液器)轉(zhuǎn)移每樣品約0.5~1 µL此粗制gDNA溶液(含有2~3 ng gDNA µL^-1)到96孔PCR板的反應(yīng)液中，適合用各種類型的PCR標(biāo)記(如簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR，插入缺失InDel等)進(jìn)行基因型檢測(cè)，或較大的DNA片段(>1 kb)的擴(kuò)增，可以得到良好的效果。本方法的關(guān)鍵是控制合適的破碎葉片量與制備溶液量比例(約2~5 mg, 但不超過(guò)10 mg 150 µL^-1溶液)，以及不要加入過(guò)多量的gDNA(不超過(guò)PCR反應(yīng)液量的1/10)，以免帶入過(guò)量的雜質(zhì)抑制PCR。因此，這種從種植材料，制備gDNA, 轉(zhuǎn)移樣品gDNA，到PCR都是96格式化操作的高通量、低成本方法適合于大量植物樣品的規(guī)�；幕蛐蜋z測(cè)。

關(guān)鍵詞：基因組DNA制備；PCR；基因分型

A High Through-Put Protocol of Plant Genomic DNA Preparation for PCR

WANG Hui-Na, CHU Zhi-Zhan, MA Xing-Liang, LI Ri-Qing, and LIU Yao-Guang^*

State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources; College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Abstract: Preparation of large numbers of plant genomic DNA (gDNA) samples for PCR in basic researches and molecular breeding in crops is a time-consuming and laborious work. In this study we developed a protocol for rapid and high through-put preparation of plant gDNA for PCR. A piece (about 30 or 40 mm in length, the same as the depth of the used 96-deep well plates) of rice (or other monocot plants) seedling leaf, or about 2-4 mg of dicot plant leaf tissue, was put into each well of 96-deep well plates. After adding a tungsten bead and 150 μL buffer (10 mmol L^-1 Tris (pH 9.5), 0.5 mmol L^-1 EDTA, 100 mmol L^-1 KCl) in each well, the plates were sealed with silicon rubber caps, and vigorously shaken with a vortex shaker for 3–5 min, followed by a brief centrifugation for a few seconds. For the pieces of monocot seedling leaves (30 or 40 mm in length), only the bottom parts (about 8 mm, ca. 2–4 mg) could be broken by the tungsten beads. Small amounts (ca. 0.5–1 μL each) of the crude gDNA solutions containing about 2–3 ng gDNA μL^-1 were directly transferred with a 96-pin replicator (or a multiple-channel pipetter) to 96-well PCR plates containing PCR solution (15–20 μL each well) for various types of PCR markers, such as Simple Sequence Repeat (SSR) and Insertion Deletion (InDel). Our tests showed that too large amounts (2 μL or more) or too high concentration (>10 mg broken tissue in 150 μL solution) of the gDNA

in PCR could suppress the amplification reaction, due to the carrying-in of higher levels of inhibitory materials from the crude gDNA solution. Therefore, it is important to control a suitable ratio of the amount of broken plant to the volume of tissue/preparation solution (ca. 2–5 mg, but no more than 10 mg in 150 μL solution). The PCR amplifications with the template gDNAs prepared by this protocol are reliable for amplification of PCR markers and relatively large (>1 kb) DNA. This 96-formated high through-put/low-cost method is especially suitable for genotyping large numbers of plant samples.

Keywords: Genomic DNA preparation; PCR; Genotyping

基于PCR的DNA檢測(cè)技術(shù)已在如基因定位、親緣關(guān)系的分析、分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)、以及種子純度鑒定等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域廣泛利用。在大規(guī)�；赑CR的基因型檢測(cè)操作中，模板DNA制備是一個(gè)影響工作效率的最重要因素之一。多年來(lái),人們一直致力于對(duì)DNA抽提方法的探討，并先后報(bào)道了一些相關(guān)的方法或簡(jiǎn)易制備法^[1-5]。但需多步驟操作，且使用微量離心管，達(dá)不到高通量的要求，樣品間DNA濃度差異大，重現(xiàn)性也不理想。本文介紹一種從種苗制備基因組DNA (gDNA) 模板、到轉(zhuǎn)移模板DNA溶液至PCR反應(yīng)液全程都采用96格式化高通量模板DNA制備的操作方法。該法不需純化和乙醇沉淀DNA，因而操作簡(jiǎn)單快速，同時(shí)還適合于從干燥植物葉片制備模板DNA。所制備的模板DNA不僅可用于大規(guī)模分子標(biāo)記(簡(jiǎn)單序列重復(fù)/微衛(wèi)星SSR, 插入缺失InDel, 酶切擴(kuò)增多態(tài)序列CAPS等)的基因型檢測(cè)，大大提高基因型分析的效率，也可用于較大DNA片段(>1 kb)的擴(kuò)增。

1 材料與方法

1.1 器具和試劑

(1) 96方孔板(2.2 mL或1.6 mL容積)及其配套硅橡膠蓋(建議使用國(guó)產(chǎn)品以降低成本)。

(2) 96針復(fù)制器(方統(tǒng)科技生產(chǎn)或自制，見(jiàn)附錄I)。

(3) 鎢合金珠(直徑3 mm，Qiagen, Cat. 69997)或不銹鋼珠（5直徑mm）。

(4) 普通渦旋器(其林貝爾QL-861)，或MTM-96研磨器(方統(tǒng)生物科技有限公司制造)。

(5) 8通道或12通道移液器。

(6) 96孔PCR板(國(guó)產(chǎn)品)。

(7) 其他PCR擴(kuò)增儀器和試劑及其電泳檢測(cè)設(shè)備。

(8) 10´制備緩沖母液：100 mmol L^-1 Tris(pH9.5), 5 mmol L^-1 EDTA, 1 mol L^-1 KCl；1´制備緩沖溶液：使用前將母液稀釋10倍。

(9) 普通Taq酶(如上海申能博彩公司產(chǎn)品)及其他PCR試劑。

(10) 其他常用試劑。

1.2 植物材料

1.2.1 水稻秧苗。將1.6-mL 96方孔板底部用6 mm電鉆頭打穿，或?qū)⑴f96孔PCR板的底部剪去約4 mm。使用時(shí)將方孔板壓入少量泥巴。每孔放入1粒萌動(dòng)的水稻種子，在自然日光下(或人工氣候箱)生長(zhǎng)至3~4片葉。其他植物小苗也可用類似方法種植。

1.2.2 水稻大植株的鮮葉片或干燥葉片。

1.2.3 其他單子葉和雙子葉植物的鮮葉片或干燥葉片。

1.3 操作方法

1.3.1 鮮葉片基因組模板DNA的制備

(1) 用手摘取水稻秧苗葉一小段(對(duì)大植株的葉片，避開主葉脈撕取約3 mm寬的一小段)，放入2.2-mL或1.6-mL的96方孔板的孔中，葉片長(zhǎng)度與方孔板深度大致相同，對(duì)其他單子葉植物葉片的操作與對(duì)水稻相同，雙子葉植物葉片量為2~4 mg(不要太多)。

2.2-mL或1.6-mL的96方孔板孔深分別為42 mm和27 mm，摘取的葉片放進(jìn)去后與孔口差不多齊平。這樣做的好處是震動(dòng)打葉片過(guò)程中葉片頂端被蓋壓著不會(huì)往上跳，而下部約8 mm以下部位(約2~3 mg)才能被打碎。只摘約6~10 mm(2~4 mg)葉片段放入孔中也行，但在震動(dòng)過(guò)程中會(huì)有葉片跳到孔壁上粘著而打不著的現(xiàn)象(震動(dòng)時(shí)珠子也只在孔下部作用)。不要將葉片摘成多個(gè)小段放入一個(gè)孔中，這樣不僅費(fèi)時(shí)，更主要的是會(huì)過(guò)量打碎葉片而抑制PCR(被打碎的葉片不要超過(guò)10 mg 150 µL^-1溶液，見(jiàn)下文和圖2)。

2.2-mL方孔板比1.6-mL方孔板的孔深，溶液不易彈到蓋子上，可減少交叉污染的機(jī)會(huì)。也可用96孔PCR板，但容易卡住鎢合金珠。

(2) 每個(gè)孔投入1粒鎢合金珠或不銹鋼珠(鎢合金珠比重大效果較好)。不推薦使用普通鋼珠，因用過(guò)的鋼珠會(huì)生銹，鐵銹會(huì)抑制Taq酶活性。用多通道移液器加入150 µL 1´制備緩沖液，也可以用去離子水或0.5 ´ TE，但對(duì)DNA保存的穩(wěn)定性不如用此緩沖液。蓋好硅橡膠蓋(可鋪上1張保鮮膜再蓋硅膠蓋，打完開蓋后丟棄保鮮膜)。

(3) 用渦旋器振動(dòng)3~5 min(如果是放入約6~10 mm長(zhǎng)度的葉片，葉片跳到孔壁上會(huì)被粘著，因此期間要在桌面拍打96孔板幾次，使粘在孔壁上的葉片落回底部)；或在MTM-96研磨器(設(shè)強(qiáng)度為中上)振動(dòng)3 min。從底部往上看，可見(jiàn)溶液變淺綠色。

(4) 用吊籃轉(zhuǎn)子離心機(jī)離心約10 s(如沒(méi)有此種離心機(jī)可省略此步驟)。

(5) 直接用作PCR模板(1.3.3)。

1.3.2 干葉片基因組模板DNA的制備

(1) 用剪刀將干葉片剪成約2~3 mm小段，放約2~3 mg到96方孔板的孔中(初次實(shí)驗(yàn)用分析天平檢驗(yàn)用量的適合度，日常操作以經(jīng)驗(yàn)?zāi)繙y(cè)即可)。

(2) 每個(gè)孔投入1粒鎢合金珠，蓋好硅橡膠蓋。放入液氮箱凍幾分鐘。

(3) 用渦旋器(或MTM-96多功能研磨器)振動(dòng)約2~3 min。放入有液氮的盒子內(nèi)凍約30 s，再振動(dòng)約2 min。

(4) 離心約30 s，以便使粘在壁和蓋上的葉片粉末落回底部。

(5) 打開蓋子，用多通道移液器加入150 µL 1´制備緩沖溶液，蓋好硅橡膠蓋。

(6) 用渦旋器(或MTM-96多功能研磨器)振動(dòng)3~5 min。

(7) 將96方孔板置約90℃水浴加熱約5 min。離心約1 min。

1.3.3 PCR反應(yīng)

(1) 分子標(biāo)記檢測(cè)用每塊96孔PCR板，配制PCR液1600 µL，含上海申能博彩公司產(chǎn)Taq酶45 U (每35 µL反應(yīng)液為1 U), 100~150 µmol L-1 dNTPs，PCR引物各約0.25 µmol L-1。如果2個(gè)標(biāo)記的產(chǎn)物長(zhǎng)度不重疊，可以在同一個(gè)反應(yīng)里做2個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增(見(jiàn)圖3-C)。用多通道移液器往96孔PCR板每孔分入15 µL。擴(kuò)增較大片段DNA(>1 kb)時(shí)，反應(yīng)體積為20~25 µL，0.8~1 U Taq酶。

(2) 用96針復(fù)制器沾取約0.5~1 µL上述的gDNA溶液轉(zhuǎn)移到PCR反應(yīng)液。用過(guò)的96針復(fù)制器要馬上泡在水中及時(shí)清洗。如果沒(méi)有96針復(fù)制器，可用多通道移液器加約1 µL模板DNA，不要加入超過(guò)1.5 µL gDNA溶液，以免降低PCR的效率。

(3) 如果需要保存模板DNA溶液一段時(shí)間，用強(qiáng)磁鐵吸出合金珠,將樣品放在20℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>

(4) 根據(jù)引物的具體情況和擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度設(shè)定合適的PCR條件(設(shè)預(yù)變性95℃ 1 min)。一般分子標(biāo)記引物(18~22 nt)的擴(kuò)增用32~35循環(huán)。按常規(guī)的聚丙酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

(5) 將用過(guò)的96方孔板洗干凈，可多次重復(fù)使用。

我們?cè)跈z測(cè)共顯性基因型(即長(zhǎng)度多態(tài))標(biāo)記的gDNA樣品中混入少于1/50量的另一種基因型DNA樣品為模板進(jìn)行測(cè)試，表明不會(huì)影響PCR產(chǎn)物的目的基因型的正確檢測(cè)（結(jié)果未顯示）。而用過(guò)的96孔板的殘留gDNA量在新配制的gDNA中的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1/100，因此不用擔(dān)心重復(fù)使用96方孔板和96針復(fù)制器殘留痕量基因組DNA的污染對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響。但對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性/陰性樣品的標(biāo)記(即PCR產(chǎn)物的有/無(wú)，如轉(zhuǎn)基因的有/無(wú))，在陰性的樣品DNA中污染痕量的陽(yáng)性樣品就可能產(chǎn)生PCR假陽(yáng)性，因此對(duì)這類標(biāo)記不要重復(fù)使用制備過(guò)gDNA的96孔板。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)制備gDNA濃度的測(cè)定

本方法制備的植物gDNA溶液未經(jīng)純化，含有RNA、蛋白質(zhì)和葉綠素等雜質(zhì)，因此不能用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。將制備的gDNA在瓊脂糖凝膠上電泳也由于DNA濃度低且呈涂抹狀而難以估計(jì)其濃度(結(jié)果未顯示)。為了較準(zhǔn)確測(cè)定該濃度，將純化定量的秈稻品種93-11的gDNA梯度系列(0.5~8 ng，作為內(nèi)參)和1 µL本方法制備的粳稻(02428)gDNA混合，用1個(gè)InDel標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明，4個(gè)測(cè)試樣品(每個(gè)樣品2~3 mg葉片，加入150 µL溶液)制備的gDNA濃度為2~3 ng µL^-1(圖1)。

圖1 用InDel標(biāo)記PCR估算所制備的水稻基因組DNA濃度

Fig. 1 Estimation of concentrations of the prepared rice genomic DNA samples by PCR with an InDel marker

將純化定量的水稻品種(93-11)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.5~8 ng)與1.0 µL本方法制備的水稻品種(02428)基因組DNA混合作為模板，用InDel 標(biāo)記引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PAGE檢測(cè)。箭頭指某反應(yīng)(或2個(gè)反應(yīng)之間)其02428與93-11條帶的信號(hào)值大致相等(即DNA等量點(diǎn))，表明02428基因組DNA量與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)DNA相當(dāng)。

Different amounts (0.5–8 ng) of standard genomic DNA from a rice variety (93-11) were mixed with 1 µL genomic DNA from another variety (02428), and used as the template for PCR with primers (Table 1) of an InDel marker. Arrows show the band intensities in the reactions (or between two reactions) of 02428 and 93-11 were similar, indicating that the amounts of 02428 gDNA were about the same as those of indicated standards.

表1 本研究所用的PCR引物

Table 1 Primers used in this study

引物編號(hào) Primer No.	序列 Sequence (5’–3’)	對(duì)應(yīng)的圖 Corresponding Figure
1	TGTGTGCTTTCGCTGAAGAGA; TGTGCTCAGCCATAGGGTGTGTT	圖1 Figure 1
2	CGACATGTTGGCTATAAGG; ACCGGCCAATATTCCTTTG	圖2-A~C, E,F Figure 2 A–C, E,F
3	ATGGTACTACACACGTTTGT; GAAACTCATACCTTACTTCA	圖2-D (左) Figure 2 D (left)
4	TGCTCATCCTGCAGCTTCTTC; CGATCGGTTATTAACTCTTCCAT	圖2-D (右) Figure 2 D (right)
5	GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG	圖2-G (上) Figure 2 G (up)
6	GAGGTAGAAACCCACCCTAAA; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG	圖2-G (下) Figure 2 G (down)
7	CCCTTACGTGCAGTACATTG; ATGCAGGCTACTTACTAGCG	圖3-A Figure 3 A
8	TCCTCCCTCTGTACCATTTG; ACGCCAAGAAAGTCATATGG	圖3-B Figure 3 B
9	TCAACCAGTGAAGGGTCGACG; CTCAGTTGTCACGATGTGAACG	圖3-C (M1) Figure 3 C (M1)
10	GCGGTTGTGAAAGGCTAATCC; AAGCAGCAGGAAATGGGAGTG	圖3-C (M2) Figure 3 C (M2)

2.2 加入不同量模板DNA的PCR效果

在一定量溶液中放入過(guò)多此方法制備的gDNA會(huì)帶入過(guò)量的雜質(zhì)，因而會(huì)抑制PCR反應(yīng)。我們的結(jié)果顯示，用2~3 mg葉片(150 µL)制備的模板(加入1 µL)的PCR效果(擴(kuò)增830 bp)比用10~12 mg(150 µL)制備的模板的擴(kuò)增效果要好(圖2-A, B)。進(jìn)一步檢測(cè)加入不同容量gDNA(用3 mg葉片150 µL^-1溶液制備)的PCR效果表明，20 µL PCR反應(yīng)中加入上述方法制備的DNA 0.5~1.0 µL的擴(kuò)增效果比加入2 µL的效果好；加入1 µL DNA和1 µL TE(含有1 mmol L^-1 EDTA)的擴(kuò)增效果更差。說(shuō)明即使控制好合適的葉片量和溶液的比例，加入過(guò)量DNA溶液也因帶入過(guò)多的雜質(zhì)和EDTA(制備液含有EDTA)而抑制PCR反應(yīng)。因此，本方法的關(guān)鍵是要控制適合的葉片量和溶液的比例，同時(shí)加入的DNA溶液量不要超過(guò)PCR反應(yīng)液的1/10。事實(shí)上，使用少至0.1~0.2 µL的模板DNA(約0.2~0.4 ng)就足以產(chǎn)生良好的PCR擴(kuò)增效果(圖2-D)，說(shuō)明模板DNA量(指低量)不是一個(gè)限制性因素。雖然將較高濃度的DNA(放入較多的葉片量)稀釋使用也可避免抑制PCR，但從操作的簡(jiǎn)單化和效率化考慮，最好直接確定一個(gè)合適的葉片量與溶液比例范圍，以減少操作步驟。在實(shí)際操作中只摘取1段長(zhǎng)度與96孔板深度相當(dāng)?shù)挠兹~放入各孔中，由于只有下端約8 mm以下部分才能被合金珠打碎，因此不會(huì)產(chǎn)生葉片量與溶液比例過(guò)高的問(wèn)題。用本方法也可從干燥葉片制備模板DNA做PCR(同樣要注意控制投入的葉片量不能過(guò)多，圖3-E, F)，適合于對(duì)野外采集和干燥保存的植物樣本的檢測(cè)。用本方法從其他植物制備的基因組DNA(如擬南芥，圖2-G)做PCR也產(chǎn)生良好的效果。

圖2 用本方法制備的植物gDNA的PCR擴(kuò)增效果

Fig. 2 PCR effects using the prepared gDNA templates

A, B: 分別從約2~3 mg水稻苗鮮葉片150 µL^-1緩沖液和約10 mg水稻苗鮮葉片150 µL^-1緩沖液制備的DNA，取1.0 µL gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 C: 從3 mg水稻苗葉片 150 µL^-1緩沖液制備的gDNA取不同量為模板進(jìn)行PCR(20 µL反應(yīng))。D: 用遞減的不同量gDNA (2~3 mg水稻苗鮮葉片150 µL^-1緩沖液) 進(jìn)行PCR標(biāo)記(InDel)的擴(kuò)增。E, F: 分別從2~3 mg水稻干燥葉片150 µL^-1緩沖液和約10 mg水稻干燥葉片150 µL^-1緩沖液制備的DNA，取1.0 µL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 G: 從約2~3 mg擬南芥鮮葉片150 µL^-1緩沖液制備gDNA，取1.0 µL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。A~C, E~G反應(yīng)為20 µL PCR反應(yīng)，含有0.8 U Taq酶。PCR條件為95℃ 2 min, 33 循環(huán)的94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min。D的PCR條件與圖3相同。

A, B: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. C: Using different volumes of rice gDNA prepared from 3 mg seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer as PCR template. D: Use of decreased amounts of gDNA (from 2–3 mg seedling leaf in 150 µL preparation buffer) for performing PCR with InDel markers. E, F: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of dried leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. G: PCR using 1.0 µL Arabidopsis thaliana gDNA prepared from 2–3 mg fresh leaf tissue in 150 µL preparation buffer. A–C, E–G were conducted in 20 µL PCRs containing 0.8 U Taq, with thermal conditions of 95℃ 2 min, 33 cycles of 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min. PCR setting and thermal conditions in D were the same as those in Fig. 3.

2.3 高通量的分子標(biāo)記檢測(cè)

本方法制備的DNA濃度雖然低，用96針復(fù)制器加入0.5~1 µL模板進(jìn)行33~35個(gè)PCR循環(huán)就可獲得足夠濃度的產(chǎn)物，并不需要加入特別多的Taq酶(甚至使用量為每45~50 µL PCR反應(yīng)液1 U也能擴(kuò)增分子標(biāo)記)。該方法已對(duì)數(shù)萬(wàn)份水稻樣品進(jìn)行了分子標(biāo)記(SSR、InDel等)檢測(cè)，成功率一般可達(dá)95%以上。事實(shí)上，用微量提取法(經(jīng)乙醇沉淀)粗提的基因組DNA往往由于樣品間濃度差別大，定量不準(zhǔn)確，容易加入過(guò)多的模板DNA而抑制PCR (粗提的基因組DNA也含有相當(dāng)多的雜質(zhì))，因而用微量提取法粗提基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的成功率和整齊度反而不如本文介紹的方法好。圖3顯示若干PCR標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)例，擴(kuò)增效果和整齊性非常好。另外，還可以在同一個(gè)反應(yīng)里做2個(gè)標(biāo)記的PCR擴(kuò)增(圖3-C)。

Fig. 3 PCR marker-based genotyping using the prepared rice seedling gDNAs as templates

A: 用SSR標(biāo)記對(duì)水稻種質(zhì)材料進(jìn)行基因型檢測(cè)。B, C: 用Indel標(biāo)記對(duì)水稻分離群體進(jìn)行基因型檢測(cè)。2個(gè)InDel標(biāo)記(M1, M2)在同一PCR反應(yīng)進(jìn)行基因型檢測(cè)(C)。所有PCR反應(yīng)是用96針復(fù)制器加入gDNA約0.5 µL，PCR條件為95℃ 2 min, 35循環(huán)的94℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 30 s. A: Genotyping of rice germplasms with a SSR marker. B, C: Genotyping of rice segregation populations with InDel markers. Two markers (M1, M2) were analyzed in the same PCRs (C).

3 討論

已報(bào)道的各種植物DNA簡(jiǎn)易制備方法大都是用微量離心管對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行編號(hào)、組織破碎、抽提、沉淀、干燥、溶解、定量多步驟操作，效率很低。本文的方法全過(guò)程采用96格式化操作，基因組DNA制備過(guò)程中不需要分別對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)簽和操作，非常簡(jiǎn)便快捷，通量高，且成本極低(國(guó)產(chǎn)96方孔板價(jià)格低，且可重復(fù)使用)。葉片采集放入96方孔板后，從加入制備溶液、震動(dòng)破碎、到轉(zhuǎn)移模板DNA至PCR液(不算PCR液配制)只需6~7 min。用96針復(fù)制器不會(huì)轉(zhuǎn)移過(guò)量的模板DNA溶液(多通道移液器取約1 µL溶液時(shí)誤差較大)，不僅快速，還節(jié)省移液頭和移液頭裝盒的人工成本。我們用此方法已制備了10多萬(wàn)份水稻樣品的gDNA用于PCR基因型分析，顯示出此方法的高效率。本文還介紹了自制96針復(fù)制器的方法供參考（附錄I）。

4 結(jié)論

本文介紹的高通量操作方法簡(jiǎn)單，效果好，省時(shí)省力，能大大提高工作效率，在基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)育種等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用。

References

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附錄I：96針復(fù)制器制作方法

(1) 將約6 m長(zhǎng)1.2 mm或1.5 mm直徑的#304不銹鋼絲(低于#304的會(huì)生銹)拉直（一端固定在柱子上，把另一端綁在木棒上，用力拉幾下）。用鋼鉗剪成每段45 mm。用鉗夾著鋼絲一端，用鋼銼(較細(xì)紋的)銼平一端的端口。

(2) 將3~4 mm厚有機(jī)玻璃板裁成80 mm  120 mm。用舊96孔PCR板沾上稀釋墨水在機(jī)玻璃板印上96個(gè)點(diǎn)。用鐵釘在每個(gè)點(diǎn)中心敲打出1個(gè)淺孔(目的是防止鉆孔時(shí)移位)。

(3) 對(duì)應(yīng)1.2 mm或1.5 mm不銹鋼絲，用稍大些直徑(如1.5 mm或1.8 mm)的電鉆頭在96個(gè)點(diǎn)垂直打孔。

(4) 用強(qiáng)力膠(如A、B兩種膠等量混合后幾分鐘內(nèi)硬化的強(qiáng)力膠)先將3根針粘結(jié)在3個(gè)角的孔中(即A1, A12, H1位置)(沒(méi)有銼平的一端粘在板上，銼平端做腳底)，等強(qiáng)力膠固化后，將第4根粘在第4個(gè)角（即H12位置），在膠固化之前將這個(gè)“4腳桌子”腳向下放在平板上，上下微移第4根針，使4根針都接觸到平板(即不翹腳)。

(5) 將其余的針(每次同時(shí)操作2~3根)粘在剩余的小孔中(銼平端作為腳)，在膠固化之前將針調(diào)整到與2端的針同一個(gè)平面(針朝下放在平板上，使每條針都接觸到板面)。

(6) 將1塊舊96孔PCR板的管底在砂布(紙)上磨至快要穿的狀態(tài)，然后套在粘好的96針上，用力壓下96孔PCR板使針把管底刺穿。使96孔PCR板管底留在針端位置(以便在下一步驟打磨時(shí)固定針端)。

(7) 將復(fù)制器半成品的針端平鋪在平整桌面上的砂布(砂紙)上來(lái)回移動(dòng)打磨，直至將所有針端磨到同一個(gè)平面。

(8) 在固定96針的有機(jī)玻璃板上面再粘一塊80 mm  120 mm機(jī)玻璃板(厚度不限)，上面再粘一個(gè)把手，就完成了制作。

(9) 檢測(cè)96針復(fù)制器每針取樣量：往96孔PCR板每孔加入30~40 µL制備緩沖液（或水），用微量分析天平稱重回零；用96針復(fù)制器沾取96孔PCR板的水1次(或?qū)⑨樥橙〉乃植粮珊笤僦貜?fù)沾取2~3次)，再稱96孔PCR板已減少的液量，算出平均每針每次的取液量。

附圖1 用不銹鋼絲（#304）自制的96針復(fù)制器 Supplementary Fig. 1 A home-made 96-pin replicator made from stainless steel wire

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標(biāo)簽：高通量PCR 植物基因組DNA制備 MTM-96研磨器

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高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法