人外周血淋巴細(xì)胞RNA的提取方法

一、采集血樣，室溫保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管進(jìn)行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般為1ml；一般地，1ml外周血中含有大約1-2*10^6個(gè)單個(gè)核細(xì)胞（PBMC，即淋巴細(xì)胞核單核細(xì)胞）。

二、提取淋巴細(xì)胞。取1.5ml 無(wú)菌無(wú)酶的離心管，為管1，先加入500ul淋巴細(xì)胞分離液；另一個(gè)1.5ml 無(wú)菌無(wú)酶的離心管中，裝有500ul血樣的真空管和500ul PBS（磷酸鹽緩沖液），1：1混勻的混合物，共1ml。然后緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細(xì)胞分離液的管1中，注意要緩慢，使血樣盡量位于提取液上層，不能太用力讓血細(xì)胞擴(kuò)散到下層，就沒(méi)辦法離心分層了。（這一步的操作應(yīng)該盡量快速的完成，因?yàn)闀r(shí)間長(zhǎng)了，紅細(xì)胞就會(huì)在重力作用下沉降，混入到提取液中，對(duì)后面的離心造成影響）然后離心。1500rpm,15min,20攝氏度。

說(shuō)明：

1、從采集血樣到開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的時(shí)間最好不超過(guò)4小時(shí)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直保持室溫條件，一般20攝氏度比較適中，因?yàn)榧?xì)胞的最適溫度是體溫37攝氏度，但是溫度降低又可以降低細(xì)胞的代謝，兩者有些矛盾，所以取中間溫度比較理想。

2、關(guān)于淋巴細(xì)胞分離液的注意事項(xiàng)：?jiǎn)⒎夂髴?yīng)置4℃保存避免微生物的污染；分離液從冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液溫度升至室 溫時(shí)，搖勻后使用； 整個(gè)分離過(guò)程中，溫度應(yīng)控制在18-28℃且在無(wú)菌環(huán)境下，避免微生物的污染，否則會(huì)影響分離質(zhì)量；未啟封前在18-25℃避光保存，啟封后置4℃保存， 本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。（各種淋巴細(xì)胞分離液的保存溫度不完全一致）
淋巴細(xì)胞分離液是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進(jìn)行細(xì)胞的分離純化的常用試劑，為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液，主要成分是葡聚糖與 泛影酸葡甲胺。適用于人淋巴細(xì)胞和大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離純化，能除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞碎片，所獲得的PBMC可進(jìn)一步用于原代培養(yǎng)或流式細(xì)胞分析。最常用的細(xì)胞分離液有Ficoll和Percoll。

3、轉(zhuǎn)數(shù)為1500rpm，時(shí)間范圍為15分鐘，溫度為室溫20攝氏度。推薦兩步離心法：首先用1500rpm/min離心15min，如果白膜層足夠一步就結(jié)束，如果發(fā)覺(jué)細(xì)胞不夠，說(shuō)明該病人的淋巴細(xì)胞比重較低，再重新用1500rpm /min離心15min。

三、離心后，分四層。淋巴細(xì)胞位于第二層（從上到下），呈白蒙蒙的一薄層。用移液器（200ul檔）吸取分離液層中的淋巴細(xì)胞，這里技巧性比較強(qiáng)，需要多 次練習(xí)才能比較熟練的把淋巴細(xì)胞吸的比較完全，大約可得到400ul的液體。把吸取的淋巴細(xì)胞溶液裝入另一無(wú)菌離心管中。加入1mlPBS緩沖液到離心管中，1500r,15min，20攝氏度。把離心后的上層液體倒掉，重復(fù)離心步驟至液體無(wú)明顯紅色（即紅細(xì)胞數(shù)量很少），淋巴細(xì)胞位于離心管底的一小點(diǎn)白色的物質(zhì)，一般會(huì)混有少量紅細(xì)胞，盡量避免。

說(shuō)明：

1、洗滌后離心的條件，通常用1500rpm就足夠了，太高了容易把細(xì)胞離死。時(shí)間為15min，溫度還是室溫20攝氏度。

2、離心后，看到淋巴細(xì)胞中混有少量紅細(xì)胞，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中問(wèn)題不大。

3、洗滌液的選擇也是平衡鹽溶液即可，作用主要是去除淋巴細(xì)胞中的血漿蛋白和血小板，紅細(xì)胞很難去掉。一般洗滌液PBS用3ml即可。

四、用Trizol reagent 裂解淋巴細(xì)胞，提取RNA。在離心管中加入1ml Trizol試劑，可以裂解除RNA以外的其他大分子物質(zhì)，細(xì)胞膜，細(xì)胞器等。這個(gè)東西有致癌、致畸性，要帶口罩，小心操作。用加液槍吹打離心管底部的淋 巴細(xì)胞團(tuán)塊，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，讓Trizol試劑充分裂解淋巴細(xì)胞。把吹打之后的液體轉(zhuǎn)移到凍存管中，標(biāo)記，浸泡進(jìn)液氮（這一步的目的是快速凍存mRNA），一到兩小時(shí)以后，轉(zhuǎn)存在 -80攝氏度冰箱中。

五、外送

說(shuō)明：

1、TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。

2、在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無(wú)RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器 皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。當(dāng)TRIZOL用量少于2-ml時(shí)建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。

3、最后用于裝裂解細(xì)胞的凍存管請(qǐng)購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌無(wú)酶的凍存管。