新物體識別、曠場實驗對小鼠認(rèn)知行為的影響機(jī)制

Ø 摘要

目的 研究年齡、性別對小鼠新物體再認(rèn)（novel-object recognition）能力和曠場活動的影響，了解兩類行為間的關(guān)系。

Ø 方法 

實驗于2004-05在安徽省老年病研究所行為學(xué)實驗室完成。入組的47只昆明小鼠被分成兩組：青年組（七八月齡，12雄、11 雌）和老年組（17、8月齡，12雄、12雌）。采用新物體再認(rèn)任務(wù)檢測小鼠的非空間短期記憶能力，采用曠場任務(wù)檢測小鼠的探索活性（locomotor）行為，并用主因子分析判斷任務(wù)間的關(guān)系。結(jié)果[ 在新物體再認(rèn)記憶任務(wù)中，老年雌鼠的新物體優(yōu)先指數(shù)為（55.6±4.9）%，顯著低于年輕雌鼠（66.6±3.7）%。在曠場任務(wù)中，老年雌鼠的探索運動活性減低，并且雌雄老年鼠在曠場周邊所花的時間［（294.4±2.0），（289.3±4.3）s］比各自對應(yīng)的青年小鼠［（278.2±4.9），（267.2±6.3）s］均多。新物體再認(rèn)成績與曠場任務(wù)中的周邊時間呈正相關(guān)，而與跨格數(shù)負(fù)相關(guān)。

結(jié)論 雌性老年昆明小鼠有新物體再認(rèn)（短期記憶）能力損害，且受曠場行為影響。

主題詞：衰老；小鼠；學(xué)習(xí)；記憶；行為

Ø 引言

小鼠年齡相關(guān)性記憶減退，尤其是空間性記憶減退，已得到了深入研究，且海馬與空間學(xué)習(xí)記憶有關(guān)已得到了充分證明［1-8］。然而，衰老對非空間性學(xué)習(xí)記憶能力的影響主要集中在電休克逃避任務(wù)上。新物體再認(rèn)記憶是海馬依賴性任務(wù)，但衰老是否影響該記憶尚無研究證明。昆明小鼠是中國實驗室最常使用的小鼠，但對其衰老相關(guān)的行為改變很少進(jìn)行探索。在目前的研究中，作者利用新物體再認(rèn)程序觀察昆明小鼠是否有年齡或性別相關(guān)性新物體再認(rèn)（novel-object recognition，一種非空間性學(xué)習(xí)記憶）能力減退。若有，是否受類似實驗環(huán)境的曠場（open-field）探索行為（locomotor）的影響。

Ø 材料和方法

設(shè)計：以實驗動物為研究對象，應(yīng)用兩因素方差分析的隨機(jī)對照、盲法試驗。

單位：一所大學(xué)醫(yī)院的神經(jīng)內(nèi)科和老年病研究所、一所大學(xué)的生命科學(xué)院。

材料：實驗于2004-05在安徽省老年病研究所行為學(xué)實驗室完成。實驗小鼠購自安徽省醫(yī)學(xué)實驗動物中心（皖醫(yī)動92002號）�？偣�47只昆明小鼠按年齡分成兩組，23只七八月齡的青年鼠（12雄、11雌）和24只17、8八月齡的老年鼠（雌雄各12只）。在實驗開始前對小鼠進(jìn)行預(yù)選，有運動障礙、脫毛、體表可見明顯腫塊及大肚的小鼠被排除。實驗開始5 周前，將小鼠飼養(yǎng)于實驗室里塑料鼠籠中（大小為25.5cm×15.0cm×14.0cm），籠內(nèi)放鋸木屑。其中雌鼠群養(yǎng)（每籠四五只）、雄，單養(yǎng)。每天至少接觸小鼠1次（拎其尾、撫摸）。除非特別提及，在整個實驗期間，動物自由進(jìn)食和進(jìn)水。喂養(yǎng)環(huán)境的明暗周期為12h（7:00開燈，19:00關(guān)燈），室溫為（21±1）℃，濕度為（55±5）% 。實驗者不知小鼠的分組。實驗在亮周期內(nèi)完成。每次實驗開始前1h，小鼠自飼養(yǎng)室移至檢測室以保持小鼠對環(huán)境的適應(yīng)。

設(shè)計、實施、評估者：為本文所有作者。實驗采用3盲方法進(jìn)行，即小鼠的分組者、實驗及評估者和數(shù)據(jù)統(tǒng)計者的工作由3人獨立完成，評估者為經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的實驗員。

方法：儀器和行為學(xué)程序按照以前出版的方法加以部分修改，作者設(shè)計了一個曠場行為程序來測定小鼠的自發(fā)性探索運動活性和焦慮性，一個新物體再認(rèn)行為程序來測定小鼠的非空間性短期記憶。

曠場實驗：儀器由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，www.softmaze.com。為一開口的黑色木盒（內(nèi)部大小為81cm×81cm），圍墻高28cm。盒底漆成縱橫各3條白線（寬3mm），從而形成16個等大的方格（每格大小20cm×20cm）。場地的中央置一彩色盒子（8cm×5cm×3cm）以激發(fā)小鼠的好奇心。照明來自一高出場地中央2.8m的40w白熾燈。每只小鼠接受1次測試，其間小鼠面朝墻放入4個拐角方格之一，并讓其自由探索環(huán)境5min。每只小鼠的測試結(jié)束后，清水清洗場地并擦干。

新物體識別：裝置由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，www.softmaze.com，是一個漆成黑色的開口木方盒子（50cm×50cm×25cm）。一白熾燈提供盒底水平約150lx的照明。在測試期間，小鼠現(xiàn)放入空盒內(nèi)并允許自由探索5min以期適應(yīng)環(huán)境。然后，將小鼠移入飼養(yǎng)籠內(nèi)。5min后，小鼠返回盒內(nèi)進(jìn)入受訓(xùn)期。此時，有兩個完全相同的物體（彩色紙盒，大小為6.0cm×6.0cm×3.5cm）于距盒壁8cm處沿一方墻直線排開。小鼠自另外兩個拐角之一放入盒內(nèi)，在自由探索5min后再被送回飼養(yǎng)籠內(nèi)。待5min間歇后，動物被再引入實驗盒內(nèi)進(jìn)行實驗期的自由探索。此時，兩個受訓(xùn)期使用過的彩色紙盒之一被一紫色小盒（7.0cm×7.0cm×5.5cm）置換并位于原位，而另一已熟悉過的彩色紙盒被移至新物體相對的拐角以防止小鼠空間的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1cm之內(nèi)指向物體或觸及鼻子則被視為探索行為。

主要觀察指標(biāo)：曠場任務(wù)是記錄實驗期內(nèi)小鼠跨越的方格總數(shù)和周邊時間(花在周邊12個方格的總時間）。在新物體再認(rèn)任務(wù)中分別記錄實驗期探索熟悉物體（TF）和探索新物體（TN）的時間。實驗期對新物體的優(yōu)先指數(shù)（PLN）被定義成TN/(TF+TN)*100%。同樣，在受訓(xùn)期也分別記錄探索物體1(T01）和物體2（T02)）的總時間，以及對物體1（PI01）和物體2（PI02）的優(yōu)先指數(shù)。受訓(xùn)期（TTTR）和實驗期（TTTE）的總探索時間也進(jìn)入統(tǒng)計學(xué)分析。

Ø 統(tǒng)計學(xué)分析

全部結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用的統(tǒng)計學(xué)方法是兩因素方差分析，年齡和性別是獨立變量。為避免不同性別在兩因素方差分析統(tǒng)計時年齡相關(guān)性成績下降的模式不同而造成的混淆，用“單性別< 的方差分析（即每個性別的單因素方差分析來顯示年齡主效應(yīng)［2］。類似地，“單年齡”的方差分析，即每個年齡的單因素方差分析）用于顯示性別主效應(yīng)。

為了探索任務(wù)內(nèi)和任務(wù)間的相互關(guān)系，作者利用了主因子分析技術(shù)［2，11］與以前的研究類似［2，11］，初始因子的模式經(jīng)Varimax法轉(zhuǎn)換，Eigen值大于1的因子得以保留。P＜0.05時被視為有顯著性。統(tǒng)計學(xué)分析由SPSS for window11.5軟件經(jīng)第一作者完成。

Ø 結(jié)果

2.1實驗動物數(shù)量分析由于周期短，實驗幾乎不對動物造成應(yīng)激、饑餓方面的影響及體力消耗，全部47只小鼠無中途脫失及死亡，所有動物的數(shù)據(jù)都進(jìn)入了結(jié)果分析。

2.2曠場實驗結(jié)果  老年雌鼠和雄鼠的平均周邊時間比各自的青年鼠顯著性延長［F(1,21)=9.96,P＜0.01;F(1,21)=8.42,P＜0.01］。這些不同主要是年齡效應(yīng)所致［F(1,45)=17.44,P＜0.01］，而性別的影響較小［F(1,45)=2.99,P=0.091］。年齡和性別的相互作用極�。跢(1,45)＜1］。

年齡和性別都不影響小鼠的跨格數(shù)［F(1,45)=2021,1.09;Ps＞0.05］，年齡和性別的相互作用對跨格數(shù)也無效應(yīng)［F(1,45)＜1］。然而，“單性別”方差分析表明老年雌鼠的探索運動活性（locomotor activity）顯著低于青年雌鼠［F(1,21)=4.87,P＜0.05］，但是，“單年齡”方差分析顯示老年雌雄小鼠間的跨格數(shù)差異無顯著性意義［F(1,21)=2.08,P＞0.05］。

2.3新物體再認(rèn)實驗結(jié)果  兩因素方差分析表明TTTR和TTTE不受年齡［F(1,45)=2.21,1.09;Ps＞0.05］和性別［F(1,45)=0.24,2.78;Ps＞0.05］的影響，但受年齡性別相互作用的強(qiáng)力影響［F(1,43)=18.39,8.02;Ps＜0.001，0.01］。進(jìn)一步的“單性別”方差分析和“單年齡”方差分析顯示老年雌鼠的TTTR和TTTE顯著短于青年雌鼠［F(1,21)=14.08,9.34;P=0.001，＜0.01］和老年雄鼠［F(1,22)=14.03,6.84;P=0.001，＜0.05］，但青年雌鼠比同齡雄鼠有較長的TTTR［F(1,21)=6.08,9.34;P＜0.05］和類似的TTTE［F(1,21)=1.31,6.84;P＞0.05］。然而，年齡、性別和年齡與性別的相互作用并不顯著影響PI01和PI02［F(1,45/43)＜1］。

對于優(yōu)先指數(shù)，當(dāng)所有動物一起分析時，重復(fù)測定方差分析表明PIn 顯著高于PI01或PI02［F(1,46)=18.77,14.81;Ps＜0.001］。提示在敞口場地內(nèi)，昆明小鼠有記住熟悉物體并習(xí)慣于優(yōu)先探索新物體的能力。影響該效應(yīng)的年齡［F(1,45)=3.97, P=0.052］而不是性別［F(1,45)＜1］和年齡與性別的相互作用［F(1,43)＜1］。兩因素方差分析表明年齡［F(1,45)=6.41, P＜0.05］顯著影響PIn，而性別［F(1,45)＜1］和性別與年齡的相互作用并無影響［F(1,43)＜1］�！皢涡詣e”方差分析顯示老年雌鼠比青年雌鼠的PIn顯著要�。跢(1,21)=4.47,P＜0.05］。

2.4主因子分析樣本適合度的KMO值（Kaiser-Meyer-Olkin measure of sampling adequacy）為0.665（＞0.05），并且在Bartlett球形假設(shè)中P＜0.001，說明本研究中所選擇的指標(biāo)適合進(jìn)行主因子分析。結(jié)果獲得了3個有顯著意義的因子。旋轉(zhuǎn)于各因子上的不同變量的成分負(fù)荷。在任務(wù)內(nèi)，新物體再認(rèn)任務(wù)的5個指標(biāo)分屬于3個不同的因子，即訓(xùn)練期和實驗期的探索總時間旋轉(zhuǎn)于因子2，訓(xùn)練期對物體1和物體2的優(yōu)先指數(shù)旋轉(zhuǎn)于因子1但方向相反，而實驗期對新物體的優(yōu)先指數(shù)旋轉(zhuǎn)與因子3；曠場任務(wù)的2個指標(biāo)均旋轉(zhuǎn)于因子3，方向也相反。在任務(wù)間，新物體優(yōu)先指數(shù)和周邊時間同旋轉(zhuǎn)于因子3而方向相反，和跨格數(shù)也同旋轉(zhuǎn)于因子3而方向相同。

Ø 討論

3.1 老年小鼠的移動探索活性曠場任務(wù)是頻繁應(yīng)用于衰老小鼠行為學(xué)研究的任務(wù)之一［1,2,12］。本文的結(jié)果顯示由跨格數(shù)代表的移動探索活性在老年雌鼠比青年雌鼠低。使用曠場或光束活性系統(tǒng)，以前的研究報告了其他許多株的衰老小鼠的移動探索活性降低［2,4,12］。代表移動探索活性的探索行為主要是沿場地的側(cè)墻進(jìn)行的，盡管有一個新奇物體（一個用于激發(fā)小鼠好奇心的彩色紙盒）位于場地中央。兩性老年昆明小鼠的周邊時間明顯長于各自的青年鼠，提示老年昆明小鼠的焦慮性高于青年小鼠。這與老年大鼠和中至老年雌雄NMRI小鼠在高架十字迷宮中的觀察一致。作者認(rèn)為，老年昆明小鼠移動探索活性的降低很可能是焦慮性增加所致，而不是像其他研究者在對老年OF1和NMRI雌鼠進(jìn)行研究時特別提到的那樣是由于探索活動減少、好奇心降低和體能下降所致，因為盡管雌雄老年昆明小鼠的焦慮性均增加，只有老年雌鼠的移動探索活性降低。本文的老年昆明小鼠在曠場中表現(xiàn)出類似焦慮性的結(jié)果與老年C57BL/6NIA小鼠在高架十字迷宮中表現(xiàn)出的結(jié)果稍有不同，即17 月齡C57BL/6NIA雌鼠（該株的中年小鼠）比同齡雄鼠和青年（5月齡）雌鼠更焦慮。然而，老年鼠（25月齡）的焦慮性與青年鼠相似。由于小鼠的曠場行為與小鼠的食物儲藏行為有一定的類似性，所以，昆明小鼠的曠場行為年齡相關(guān)性改變可能受其年齡相關(guān)性食物儲藏行為改變的影響。

3.2老年昆明小鼠非空間認(rèn)知能力的改變在本研究中，作者用了新物體再認(rèn)任務(wù)來測定昆明小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力是否隨衰老而改變。該任務(wù)是海馬依賴性任務(wù)之一，并且很少用于衰老小鼠認(rèn)知能力的評價。老年雌鼠比青年雌鼠的PIN小，提示老年雌雄昆明小鼠的非空間短期記憶的某個方面有損害。最近，不同探索時間對PIn的效應(yīng)已得到研究。為了獲得PIn，已有人推薦總探索時間要累計到相同水平。在老年雌鼠，盡管過短的探索時間對老年雌鼠認(rèn)知功能損害產(chǎn)生了效應(yīng)的可能性不能完全排除，老年雌鼠在新物體再認(rèn)任務(wù)中的較差表現(xiàn)很可能還是源自自身的認(rèn)知功能損害。其理由是：盡管老年雌鼠在受訓(xùn)期和實驗期的探索總時間確實要短于青年雌鼠，但兩組小鼠在受訓(xùn)期在物體1和物體2上各花了50%的時間。在實驗期，盡管青年雌鼠在新物體上花去了67%的時間（Pin=0.667），但老年雌鼠花在新物體上的時間僅56%（Pin=0.556）。這提示老年雌鼠可能由于認(rèn)知能力損害而不能區(qū)別熟悉物體和新物體，從而導(dǎo)致花在新物體上的時間過少。

3.3 認(rèn)知任務(wù)中性別的差異在各種不同的種屬，空間學(xué)習(xí)記憶能力的性別差異已充分證明。在八臂輻射狀迷宮任務(wù)中，青年雌鼠的成績比雄鼠好。對于正常衰老的小鼠，很少有資料直接顯示認(rèn)知能力下降的性別差異。Frick等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17月齡雌性C57BL/6NIA小鼠在Morris中表現(xiàn)出更多的空間參考記憶損害，但25月齡小鼠并無性別差異。本文結(jié)果提示某些非空間認(rèn)知能力，如新物體再認(rèn)能力的年齡相關(guān)性下降，在雌性要比雄性出現(xiàn)早。值得提及的是像以上討論的那樣，本實驗中所顯示的性別和年齡相關(guān)性非空間的學(xué)習(xí)記憶損害也許是雌（群養(yǎng)）雄（單養(yǎng)）小鼠之間不同的飼養(yǎng)環(huán)境所致。然而，飼養(yǎng)效應(yīng)可能不是主要的混雜因素。其理由是：1年齡相關(guān)性學(xué)習(xí)記憶能力的損害僅發(fā)生在群養(yǎng)的老年雌鼠而不是單養(yǎng)的老年雄鼠身上。2在新物體再認(rèn)任務(wù)中，老年雄鼠的成績優(yōu)于老年雌鼠。3單養(yǎng)的青年雄鼠的成績好于群養(yǎng)青年雌鼠。當(dāng)然，最后的結(jié)論尚需單養(yǎng)或群養(yǎng)雌雄鼠才能獲得。

3.4 任務(wù)內(nèi)和任務(wù)間指標(biāo)的相互關(guān)系主因子分析已用于研究老年和青年小鼠以區(qū)別屬于不同學(xué)習(xí)記憶任務(wù)指標(biāo)的性質(zhì)，但它并未用以區(qū)別學(xué)習(xí)記憶任務(wù)和感覺運動任務(wù)指標(biāo)的性質(zhì)。本文的結(jié)果顯示新物體再認(rèn)任務(wù)內(nèi)的指標(biāo)測定的可能是認(rèn)知功能的不同方面，曠場任務(wù)則測定的是感覺運動功能方向相反的方面。一些以前的研究試圖確定不同行為任務(wù)組內(nèi)任務(wù)間的相互關(guān)系，但所獲的結(jié)論是相互抵觸的。在一個任務(wù)組內(nèi)，僅發(fā)現(xiàn)17~22 月齡NMRI小鼠較高的曠場運動活性與其在Morris水迷宮內(nèi)的成績負(fù)相關(guān)。在另一研究中，又發(fā)現(xiàn)了許多任務(wù)間的相互關(guān)系。在本文的任務(wù)組內(nèi)，曠場測定的是移動探索活動成分。顯然，新物體再認(rèn)任務(wù)也由明顯的移動探索成分。

結(jié)論：本文的結(jié)果顯示，新物體再認(rèn)的與曠場跨格數(shù)正相關(guān)，而與周邊時間負(fù)相關(guān)。這提示昆明小鼠的移動探索活性越強(qiáng)，新物體再認(rèn)能力也越強(qiáng)。與此相反，昆明小鼠的焦慮性越大，其新物體再認(rèn)能力也越差。