摘要:用D-半乳糖(D-gal)建立衰老動物模型且海馬內(nèi)微注射βAP ,檢測各組大鼠開場行為、Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)和一次性被動回避反應(yīng)的變化的方法,研究β-淀粉樣蛋白(βAP)對衰老大鼠開場行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響. 結(jié)果是D-gal + NS組、D-gal +βA P組大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)活動和探究行為減少,學(xué)習(xí)記憶減退,與NS + NS組比較有顯著性差異( P< 0. 05 ,P< 0. 01) . 該文得出的結(jié)論是βAP與D-gal聯(lián)合使用可導(dǎo)致腦老化程度加重,學(xué)習(xí)記憶能力顯著減弱.

關(guān)鍵詞:β-淀粉樣蛋白; 開場行為; 學(xué)習(xí)記憶; 衰老　　

β-淀粉樣蛋白(β- amyloidp rotein ,βAP)是老年性癡呆患者的大腦中特有的一種蛋白,它在老年性癡呆的發(fā)病機(jī)理中的作用已引起人們的重視. 生化研究表明,β-淀粉樣蛋白是老年性癡呆患者腦海馬和皮層老年斑(SP)的主要成分,它與AD的病理形成過程關(guān)系密切. 已有報道βA P對正常大鼠海馬神經(jīng)元的毒害作用,但有關(guān)βAP對衰老大鼠的作用,國內(nèi)外均未見報道,本實驗試圖在D-半乳糖所致衰老動物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行海馬內(nèi)注射βAP ,觀察其對大鼠開場行為和空間分辨學(xué)習(xí)以及記憶保持能力的影響.

    1　材料與方法

1 . 1　動物和試劑

雄性健康SD大鼠,體重100～120g(江蘇省實驗動物中心提供) , βA P為Sigma公司產(chǎn)品(βA P1 -40 ,Lot NO. 76 H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 為上海試劑二廠產(chǎn)品.

1 . 2　分組和模型建立

將大鼠隨機(jī)分成4組: ①生理鹽水N S + N S組; ②N S +βA P組; ③D-gal + N S組; ④D-gal +βA P組- 1連續(xù)注射6周建立衰老動物模型; ①、②組. ③、④組動物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg- 1d動物腹腔注射等量生理鹽水. 于第4周進(jìn)行雙側(cè)海馬內(nèi)注射βA P ,每側(cè)注射1μL(4μg/μL) ;對照組注射等量生理鹽水. 海馬定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥鈉(40 mg. kg-1)麻醉,立體定位儀(日本NARISHIGESN - 3型)上固定,坐標(biāo)按照圖譜,以前囪定位: A P = - 3 . 5 mm , ML = ±2 . 0mm , H = 2 . 7 mm ,鉆開顱骨,用微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針,每側(cè)注射時間為5min ,留針5min ,緩慢起針,局部消毒后縫合皮膚,肌注抗生素抗感染.

1 . 3　行為學(xué)檢測

連續(xù)腹腔內(nèi)注射6周后進(jìn)行.

1 . 3 . 1　開場行為(open field):將動物置于圓形開場檢測箱底中央的格內(nèi),記錄其在3 min跑動(locomotion)穿過的格數(shù),后肢站立(rearing)次數(shù)、梳理(grooming)次數(shù)及糞便顆粒數(shù). 比較不同組間大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)行為和探究行為表現(xiàn)的差異.

1 . 3 . 2　Y -迷宮分辨學(xué)習(xí)(Y- maze discrimination learning)能力檢測Y-迷宮為三等分輻射式反射箱. 以大鼠被電擊

后逃至安全區(qū)為一次正確反應(yīng),連續(xù)10次測試中有9次(90 %)正確反應(yīng),定為學(xué)會標(biāo)準(zhǔn). 記錄每個大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)的訓(xùn)練次數(shù). 所有檢測過程均由計算機(jī)完成.

1 . 3 . 3　一次性被動回避反應(yīng)(o ne- t rial passiveavoidance respo nse)根據(jù)大鼠趨暗習(xí)性,記錄其在通道上的停留時間,即步入潛伏期(step-t hrough latency , STL) ;動物進(jìn)入暗箱后立即給予電擊(0 . 3 mA ,5 s) ; 24 h 后檢測大鼠的S TL .以S TL作為記憶保持的指標(biāo), S TL越長表明對電擊的記憶保持越好. 檢測以240 s為限.本實驗數(shù)據(jù)用( X±SŠX( X表示,組間差異用t檢驗;一次性被動回避反應(yīng)采用Mann- whit ney非參數(shù)檢驗

    2　結(jié) 　　果

2 . 1　不同組大鼠開場行為觀察結(jié)果見表1 ,統(tǒng)計處理表明,在開場行為諸參數(shù)中,D-gal +βAP組動物與NS + NS組比較糞便顆粒數(shù)有顯著性差異( P< 0 . 05) ,而跑動格數(shù)則極明顯減少( P< 0 . 01) ,前者在新異環(huán)境中自發(fā)活動和探究反應(yīng)明顯下降,緊張恐懼狀態(tài)也降低. D-gal + NS組動物跑動格數(shù)與NS + NS組比較也有顯著性差異( P< 0 . 05). NS + NS組與NS +βA P組之間雖無顯著性差異,但其跑動格數(shù)、站立次數(shù)均有下降趨勢,說明βA P單獨使用對大鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動及探究行為也有一定影響.

2 . 2 　Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)能力檢測

達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù), N S + N S 組:21 . 4±2 . 6 ;N S +βAP組:34 . 6±5 . 5 ;D-gal + NS組:42 . 4±5 . 4 ;D-gal +βA P組:48 . 0±5 . 6 . 前兩者比較無顯著性差異( P> 0 . 05) ,D-gal + NS組與NS + N S組比較有顯著性差異( P< 0 . 05) ,而D-gal +βPA組與N S + N S組比較,達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)極明顯增加( P< 0 . 01) ,說明D-gal所致衰老模型大鼠的分辨學(xué)習(xí)能力顯著降低,而在衰老動物模型上海馬內(nèi)注射βAP更使學(xué)習(xí)能力極顯著下降.

2 . 3　一次性被動回避反應(yīng)

D-gal +βAP組記憶保持能力明顯下降,電擊后24 hSTL顯著縮短,與NS + NS組和D-gal + NS組比較有顯著性差異( P< 0 . 05). 其他組之間比較,差異無顯著性,但記憶保持能力呈逐漸降

低趨勢

    3　討 　　論

有研究報道,對大鼠連續(xù)注射D-半乳糖引起擬衰老效應(yīng),可導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶能力下降,腦內(nèi)

超氧陰離子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD)活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 這說

明D-半乳糖誘發(fā)的自由基蓄積引起的脂質(zhì)過氧化損傷,是產(chǎn)生擬衰老變化的原因,這必然也會引起衰老性腦功能的衰退.βAP是老年性癡呆患者最早出現(xiàn)的典型的病理學(xué)特征. 一些學(xué)者認(rèn)為, βAP可引起學(xué)習(xí)記憶減退、認(rèn)知障礙等是AD各種病理和臨床表現(xiàn)的始發(fā)因素. βAP具有沉積作用和神經(jīng)毒性,較高濃度的βAP能引起神經(jīng)退化和死亡;βAP的神經(jīng)毒性作用可以增強(qiáng)或加大各種傷害性刺激的細(xì)胞損傷效應(yīng),此外它還具有直接的細(xì)胞毒性. 但Morimoto報道,在大鼠海馬神經(jīng)元,單獨注射βAP不能產(chǎn)生特定的神經(jīng)毒性作用,僅能引起少量的神經(jīng)元變性. 無論在體外培養(yǎng)細(xì)胞,還是在體內(nèi)研究中,βAP是否具有神經(jīng)毒性作用還存在著爭議,其原因可能是所用βAP的濃度不同所致.

. 本研究結(jié)果

表明海馬內(nèi)單獨注射βAP不能引起明顯的行為學(xué)變化,但在衰老動物模型基礎(chǔ)上經(jīng)βAP處理后,可導(dǎo)致動物自發(fā)活動及學(xué)習(xí)記憶行為明顯降低,說明D-半乳糖和βAP有疊加效應(yīng). 學(xué)習(xí)記憶是腦的高級功能,學(xué)習(xí)記憶減退是腦功能衰退的表現(xiàn). 因此,本實驗結(jié)果提示,在D-半乳糖所致衰老動物基礎(chǔ)上,海馬內(nèi)注射βAP ,可望作為更接近AD的一種動物模型. 但它是否具有AD的各種病理學(xué)特征,還有待于做進(jìn)一步研究