3.比色計(jì)原理
原理
當(dāng)單色光通過厚度相同，而濃度很小的溶液時(shí)，根據(jù)朗伯—比爾定律，光被溶液吸收的程度，稱為吸收度，與溶液的濃度成正比，與溶液的厚度成正比，即A=εCL，式中：A為吸收度，C為溶液的濃度，L為溶液的厚度，ε為消光系數(shù)。
由朗伯—比爾定律得，當(dāng)一束單色光通過一溶液時(shí)，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱。若溶液的濃度（或厚度）不變，則溶液的厚度（濃度）愈大，光線強(qiáng)度的減弱也愈明顯。
    用同樣的方法配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液，其濃度分別為C1和C2，對(duì)同類溶液ε相同，當(dāng)厚度也相同時(shí)則：
A1=εC1L
A2=εC2L
C2=（A2/A1）*C1
    式中A1,A2可由直接讀出，C1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的已知濃度，據(jù)此可算出待測(cè)溶液的濃度。
朗伯—比爾定律
許多化學(xué)物質(zhì)的溶液具有顏色（無(wú)色的化合物也可以加顯色劑經(jīng)反應(yīng)生成有色物質(zhì)），當(dāng)有色溶液的溶度改變時(shí)，顏色的深淺也隨之改變，濃度愈大，顏色愈深。因此，可以用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度。這種方法叫做比色分析法。
一、 朗伯—比爾定律
當(dāng)一束單色光通過有色溶液時(shí)，入射光線的一部分被器皿反射回來(lái)，一部分被溶液吸收，另一部分則透過溶液，如圖所示。它們之間有以下關(guān)系：
Io=Ia+Ir+It      1-1
式中：Io—入射光強(qiáng)度，Ia—吸收光強(qiáng)度，Ir—反射光強(qiáng)度，It—透過光強(qiáng)度
由于在實(shí)際測(cè)定時(shí)，所用的比色皿都是同質(zhì)料用規(guī)格的。反射光的強(qiáng)度為一定值，不會(huì)引起測(cè)量誤差，所以反射光的影響可以不加考慮。則上式可簡(jiǎn)化為：
Io=Ia+It        1-2
從式1-2可知：當(dāng)入射光強(qiáng)度Io為一定時(shí)，被吸收光強(qiáng)度Ia愈大，則透過光強(qiáng)度It愈小。也就是說(shuō)：光強(qiáng)度的減弱僅與有色溶液對(duì)光線的吸收有關(guān)。
那么，溶液對(duì)光線的吸收與哪些因素有關(guān)呢？實(shí)驗(yàn)證明：溶液的濃度C愈大，液層厚度L愈厚（即光線在溶液中所經(jīng)過的路程愈長(zhǎng)），則溶液對(duì)光線吸收的愈多。它們之間的關(guān)系有下式?jīng)Q定：
lg = KCL      1-3
這個(gè)公式就是朗伯—比爾（Lambert---Beer）定律。
公式中的K稱為吸光系數(shù)，它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度。在入射光的波長(zhǎng)、溶液種類和溫度一定的條件下，K為定值。吸光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一，在比色分析中有著重要的意義。K值愈大，表示該物質(zhì)對(duì)光的吸收能力愈強(qiáng)，濃度改變時(shí)引起吸光度的改變愈顯著，因此比色測(cè)定時(shí)靈敏度愈高。
朗伯-比爾定律即有色溶液對(duì)一定強(qiáng)度光的吸收程度，與液層厚度和溶液中有色物質(zhì)濃度的乘積成正比。其中朗伯定律說(shuō)明吸收光與厚度間的關(guān)系；比爾定律說(shuō)明吸收光與濃度間的關(guān)系。
朗伯—比爾定律在光電比色計(jì)中的應(yīng)用
假定有兩種有色溶液，其中一種是已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一種是待測(cè)溶液。根據(jù)公式：
在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As=KsCsLs 1-4
在待測(cè)溶液中：Ax=kxCxLx 1-5
將式1-4除以式1-5可得：
= 1-6
如果上述兩種溶液的液層厚度相等、溫度相同而且是同一種物質(zhì)的兩種不同濃度的溶液，測(cè)定時(shí)所選用的單色光的波長(zhǎng)亦相同，則有：
Ls=Lx、Ks=Kx ，代入式1-6可得：
= 1-7
由此可見，在上述條件下，吸光度與濃度成正比。這一關(guān)系式就是光電比色計(jì)的設(shè)計(jì)依據(jù)，也是比色分析的基本計(jì)算公式之一。式中標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Cs為已知，As和Ax可用光電比色計(jì)測(cè)量出來(lái)，則待測(cè)溶液的濃度Cx即可求出：
Cx = × Cs 1-8
由于在實(shí)際測(cè)定時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液都要加以稀釋，而且在報(bào)告結(jié)果時(shí)，多以100毫升（或1000毫升）中的含量來(lái)表示。因此，在實(shí)際計(jì)算時(shí)，就需要在上式中乘上稀釋因數(shù)。
求待測(cè)溶液濃度的方法有：直接比較法（計(jì)算法）、因數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法三種。這些方法在“生物化學(xué)及生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)”課程中有介紹。
波長(zhǎng)的選擇：
由于有色溶液對(duì)光的吸收具有選擇性，因此進(jìn)行比色測(cè)定時(shí)，濾光片必須加以選擇，否則靈敏度很低，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。選擇濾光的一般原則是：濾光片最大透過的光線應(yīng)該是溶液最大吸收的光線。從顏色上看，濾光片的顏色與待測(cè)溶液的顏色應(yīng)為“互補(bǔ)色”。
什么叫做互補(bǔ)色呢？凡是兩種顏色相加后能得到白色，則此兩種顏色就稱為“互補(bǔ)色”，圖中直接相對(duì)的兩種顏色，均為互補(bǔ)色。
為什么選擇濾光片時(shí)，要使濾光片的顏色與待測(cè)溶液的顏色為互補(bǔ)色呢？這是因?yàn)闉V光片和有色溶液具有相似的透光特性，與它們本身顏色相同的色光，能夠最大限度地透過。而與它們本身顏色成互補(bǔ)的色光都能被最大地吸收。