Rene´ Ha¨ gerling1,7, Cathrin Pollmann1,7,Martin Andreas1, Christian Schmidt1,Harri Nurmi2, Ralf H Adams3, Kari Alitalo2,Volker Andresen4, Stefan Schulte-Merker5,6and Friedemann Kiefer1,* The EMBO Journal (2013), 1–16

摘要：在哺乳動物發(fā)育過程中，主靜脈血管中的一個內(nèi)部細(xì)胞亞群開始表達(dá)淋巴管特異基因，進(jìn)而發(fā)育出初級的淋巴結(jié)構(gòu)，被共同命名為淋巴囊。淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的出芽，擴(kuò)展，膨脹被認(rèn)為是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞從主靜脈中產(chǎn)生的基礎(chǔ)，但是淋巴管形成的確切機(jī)制仍然不為人所了解。使用選擇性光片照明顯微鏡Ultramicroscope來觀察進(jìn)行整體免疫染色的小鼠胚胎，我們觀察到細(xì)胞分辨率的完整的發(fā)育中的血管系統(tǒng)。本文中，我們報道了可以被檢測到的最早的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞松散的連接在主靜脈和淺表的脈管叢。下一步的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞聚集導(dǎo)致了兩個清晰的，未被預(yù)先確認(rèn)的淋巴結(jié)構(gòu)，背部外周縱向淋巴管和腹側(cè)初級胸導(dǎo)管，它們在后期階段形成了一個與主靜脈的直接連接。我們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子C和基質(zhì)組分CCBE1對于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞出芽和遷移是必不可少的�？傊�，我們提供了一個明顯更加細(xì)節(jié)化的視角和早期淋巴管發(fā)育的新穎模型。

圖1. 初始淋巴祖細(xì)胞從主靜脈中產(chǎn)生。
（A-D）受精后9.5/9.75(A,C)和10.5（B，D）天小鼠胚胎血管系統(tǒng)的整體染色。PECAM-1優(yōu)先染動脈、靜脈血管中的內(nèi)源粘蛋白。Prox1識別的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。（A）中框出了胸頸靜脈區(qū)，淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。DA，背主動脈；ISA，節(jié)間動脈；PAAs，咽弓動脈。標(biāo)尺100um。E 圖示箭頭穿越一對主靜脈之一。靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，藍(lán)色；發(fā)育中的心臟，暗綠；淺表靜脈叢的位置被標(biāo)示出來。CCV，一般主靜脈；SV，靜脈竇；H，心臟；ISV，節(jié)間血管。（F）成對CCV和導(dǎo)流入心臟的SV的三維重構(gòu)。移開一半對稱主靜脈后的ISVs和生肌刀（M）。藍(lán)色箭頭指示靜脈血的流動。（G）胸頸靜脈區(qū)的橫切面。DA，ISA和動脈叢標(biāo)記紅色；CV，ISV和sVP標(biāo)記藍(lán)色。NT，神經(jīng)管；DRG,背根神經(jīng)節(jié)；iLECs，初始淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。（H-K）整體免疫染色胚胎的圖片左側(cè)標(biāo)注的蛋白分布的光學(xué)切片的3維重建。E，受精后幾天的發(fā)育階段（H，I，K橫切面；J矢狀切面）。白色箭頭，新出現(xiàn)的iLECs；點線，CV的背根。標(biāo)尺100um。（L-O）在E10.0和E10.25期間出現(xiàn)的最早iLECs的圖解。Prox1+細(xì)胞，綠色，黃色為細(xì)胞核。以綠色表面表明在CCV移開分支中的Prox1表達(dá)區(qū)。

圖2. 淋巴內(nèi)皮細(xì)胞從CV的出芽伴隨著細(xì)胞和核的形狀改變，以及一個蛋白標(biāo)記開關(guān)的表達(dá)。
（A,B）整體免疫染色胚胎的CCV中左側(cè)標(biāo)注蛋白的矢狀視圖。受精后的發(fā)育階段（E）；iLECs初始淋巴內(nèi)皮細(xì)胞；頭蓋處，左；尾部，右。標(biāo)尺100um。CV的上出口，從鱗狀到紡錘狀的LEC形狀改變（箭頭指示CV根中的Prox1+ ECs）。白色箭頭，iLECs間極薄的連接；紅色箭頭，照亮的靜脈血管中頻繁的發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞（但iLECs中從沒有）。（B）也可以看到相應(yīng)的圖解1O。（C）在E10.5階段，出現(xiàn)的iLECs中的VEGFR-3及其聯(lián)合受體Nrp2水平被上調(diào)，而CV和iLECs中的Lyve-1水平保持不變。***P<0.001，NS，不顯著。（D,E）隨著iLECs的出現(xiàn)核的形狀從圓形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形。通過核表面重構(gòu)描述了CCV內(nèi)部和外部的Prox1+細(xì)胞核以及對球率和橢球率做散點圖（E）。標(biāo)尺100um。（F-H）矢狀（F）和橫切面（G，H）視圖中整體免疫染色小鼠胚胎的CCV內(nèi)部和外部的Prox1+細(xì)胞核表面重構(gòu)。（F，G）通過熱成像賦以偽色標(biāo)記的Prox1表達(dá)強(qiáng)度圖，例如，最高強(qiáng)度的表達(dá)標(biāo)記為紅色，低強(qiáng)度表達(dá)標(biāo)記為藍(lán)色。（H）通過圖像的疊加進(jìn)行細(xì)胞的解剖學(xué)定位軟件包：Imaris Vantage，標(biāo)尺100um

圖3. iLECs在節(jié)間血管主要分支的水平上濃縮來形成照亮的外周縱向淋巴管（PLLV）。
（A-D）每張圖所展示蛋白的整體免疫染色胚胎光學(xué)切片的矢狀圖重構(gòu)。E，受精后的發(fā)育天數(shù)；頭蓋的，左；尾端的，右。（A）在iLECs出現(xiàn)的早期階段，iLECs以扇形模式分布，從CCV向頭部和尾部擴(kuò)展。虛線，iLECs檢測的邊界。（A-D）iLECs在節(jié)間血管側(cè)枝的水平上立即濃縮形成PLLV。長的陰影線指示了CCV和SV的位置；短的陰影線，iLECs濃縮和PLLV形成的區(qū)域。（E-H）圖解iLECs的位置，在E10.5和E10.7階段出現(xiàn)在CV的背部。CCV之外的Prox1+iLECs以淡綠色標(biāo)記，CV內(nèi)的Prox1+細(xì)胞和心肌以深綠色標(biāo)記。在CCV移開的分支中的Prox1表達(dá)域（P1ED）以淡綠色表面顯示。淺表靜脈叢作為iLECs的一個可能的備選來源，其位置標(biāo)注為藍(lán)色（G，H）。sVP內(nèi)的Prox1+內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)注為紅色。sVP，淺表靜脈叢；標(biāo)尺100um

圖4. CV和PLLV之間的LECs聚集并形成不斷增長的更大的被照亮結(jié)構(gòu)并最終形成原始的胸導(dǎo)管。來自整體免疫染色的小鼠胚胎光學(xué)切片的圖中標(biāo)注蛋白的（A-C）矢狀圖和（D）截面圖。
（A)箭頭指示了位于CV和PLLV之間的LECs快速和不斷進(jìn)行的聚集，這導(dǎo)致了更大照明結(jié)構(gòu)pTD的形成（B-D）。（C，D）淺表淋巴管sLECs開始從PLLV背側(cè)和pTD旁邊伸展。PLLV和pTD在pTD頭蓋端連接到一起。（F-H）圖示了導(dǎo)致pTD成形的細(xì)胞聚集和濃縮事件。（I）在E11.5階段，sLECs中的VEGFR-3和它的聯(lián)合受體Nrp2水平上調(diào)，而Lyve-1水平與CV和iLECs相比強(qiáng)烈下調(diào)。***P<0.001。發(fā)育階段（E）；頭蓋，左，尾端，右。ACV，前主靜脈；CCV，一般主靜脈；PCV，后主靜脈；ISV，節(jié)間靜脈；PLLV，外周縱向淋巴管；pTD，原始胸導(dǎo)管；sLECs，淺表淋巴結(jié)。標(biāo)尺100um

圖5. 通過最高水平表達(dá)的Prox1表征的pTD和CV間新形成的成對的接觸點。
（A-C）整體免疫染色胚胎的矢狀圖。新形成中的pTD快速鞏固進(jìn)一個巨大的照明結(jié)構(gòu)，頭顱部以U形連接到PLLV（左側(cè)A，B）。CV和pTD間的兩個連接表達(dá)最高水平的Prox1（箭頭）。（B-E）一個總是位于pTD和CV連接間的作為鎖骨下動脈的短暫存在的側(cè)枝被星號標(biāo)記出來。（C）紅色箭頭：pTD內(nèi)堆積的紅細(xì)胞。箭頭標(biāo)注pTD連接端對面的Prox1+細(xì)胞。（D，E）通過pTD和CV連接區(qū)域的單個平面（光學(xué)切片）。（F-H）圖示pTD和CV間接觸點的發(fā)育，接觸點處高表達(dá)的Prox1+細(xì)胞標(biāo)記為暗綠色和紅色的細(xì)胞核。標(biāo)尺100um

圖6. 不同的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞群表達(dá)不同的標(biāo)記蛋白組。
（A-G）所示發(fā)育階段的免疫染色胚胎的橫向冷凍切片。可見的抗原被以每幅圖上所標(biāo)記的相應(yīng)顏色標(biāo)記。典型例證標(biāo)記表達(dá)的面板在（I）中匯總。（A）在E10.0階段的LECs細(xì)胞中沒有粘蛋白的表達(dá)，在E11.0階段首先被檢測到并在E12.0的LECs中變得豐富。注意CV中的Prox1+細(xì)胞在所有階段都是陰性。在E11.5階段，Nrp2在CV和pTD內(nèi)中等強(qiáng)度的表達(dá)，而CV外的iLECs強(qiáng)烈的表現(xiàn)為陽性。（C）內(nèi)皮粘蛋白在iLECs中只有短暫的留存。（D）在CV和pTD的Prox1+ ECs中Lyve-1強(qiáng)烈表達(dá)，而在展示的sLECs中僅有殘留的表達(dá)（箭頭）。（E）在所有血管結(jié)構(gòu)中，整合蛋白α6有中等程度的表達(dá)。（F）在E11.5階段，神經(jīng)生長因子Netrin-4在BECs中強(qiáng)烈表達(dá)，在CV中很弱的表達(dá)，在pTD內(nèi)中等程度的表達(dá)，但在iLECs中（箭頭）沒有被檢測到。（G，H）Unc5B在iLECs（G，箭頭）和sLECs（H，箭頭）中強(qiáng)烈表達(dá)，而在pTD中表達(dá)微弱。 (H)來自整體免疫染色的小鼠胚胎的Prox1 (綠) 和Unc5B (藍(lán))光學(xué)切片的矢狀重構(gòu). (I)在妊娠中期，不同LEC群中標(biāo)注蛋白的表達(dá)。數(shù)據(jù)來自免疫染色的冷凍切片或整體免疫染色。表示的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞群： CV, 主靜脈; iLECs, 初始LECs (輪從CV中出現(xiàn)的紡錘狀LE,松散連接的細(xì)胞); sLECS, 淺表LECs (從PLLV (背側(cè))中伸出的LECs); pTD, 初始胸導(dǎo)管. CV*, 對CV背側(cè)Prox1+細(xì)胞的表達(dá)限制。標(biāo)尺100um

圖7. CCBE1缺陷導(dǎo)致的Prox1+細(xì)胞從CV分離的失敗，并導(dǎo)致初始淋巴結(jié)構(gòu)的快速損失。

Figure 8

VEGF-C（血管內(nèi)皮因子C）缺陷的小鼠胚胎中的Prox1+內(nèi)皮細(xì)胞因為不能離開它們起源處的血管從而標(biāo)記了LECs的靜脈來源。E10.75階段野生型(A, B)和Vegfc_/_型(C–F)胚胎的矢狀圖3D重構(gòu)，對標(biāo)注蛋白做了整體免疫染色。在VEGF-C缺陷胚胎中，Prox1+內(nèi)皮細(xì)胞不能離開靜脈血管導(dǎo)致沒有出現(xiàn)發(fā)育中的淋巴結(jié)構(gòu)。(E, F) 除了CV（箭）中的Prox1+ 細(xì)胞, 在腹側(cè)sVP（箭頭）處更大的靜脈血管中捕獲了第二群Prox1t淋巴初始組織 。(G, H) 圖示了野生型 (G) 和VEGF-C缺陷型(H)胚胎中的Prox1+細(xì)胞。NE, 神經(jīng)元的Prox1+表達(dá)條紋。sVP, 淺表靜脈叢。標(biāo)尺100 um

Figure 9. 在iLECs外出和淋巴管形成過程中，CCBE1和VEGF-C協(xié)同的相互作用。
對E10.5階段所標(biāo)注蛋白整體免疫染色的野生型(A–C), Vegfct/_ (D–F), Ccbe1t/_ (G–I) 和 Vegfct/_/Ccbe1t/_ (J–L) 胚胎矢狀圖的3維重構(gòu)。CCV和ISVs的根部用虛線標(biāo)注，Prox1+細(xì)胞用箭頭標(biāo)注。與野生型同窩小崽相比，Vegfct/_胚胎(A–C)表現(xiàn)出iLECs從CCV中遷出的下降(D, E)。與之相反，Ccbe1t/_胚胎中，受損的ISVs形成被檢測到。而且，不典型的，照亮的分支出現(xiàn)在Prox1+和高水平VEGFR-3表達(dá)的主靜脈根部(G–I). (J–L) 在復(fù)合的雜合胚胎中，這種表型非�？鋸埖乇砻髁薞EGF-C 和CCBE1在淋巴管形成過程中的協(xié)同作用。標(biāo)尺100um