全自動高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)應用

——腫瘤學研究：細胞周期及凋亡全自動分析

 摘要 

        在腫瘤學研究及治療過程中，監(jiān)控細胞周期及凋亡的狀態(tài)是一個非常重要的指標。 與傳統(tǒng)的檢測方法相比，如流式細胞FACS，全自動高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)可對原位（無需消化懸浮處理）細胞進行全自動成像，并完成單個細胞水平的多參數(shù)分析。^TM圖像分析及獲取軟件具有一系列常用且操作簡單的應用分析模塊。^TM細胞生物學分析軟件可對高內(nèi)涵成像分析產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進行可視化管理及數(shù)據(jù)挖掘。

        軟件中的細胞周期分析模塊，就是專門為細胞周期及凋亡分析開發(fā)的應用模塊[Fig 1]。該模塊采用自適應背景扣除技術(shù)（Adaptive Background Correcton^TM, ABC），排除因樣品制備等原因帶來的背景不均勻的問題，準確的將細胞與背景區(qū)分開來。該模塊可對簡單的均質(zhì)DNA染料（如DAPI/Hoechst/PI）染色后的細胞進行細胞周期狀態(tài)分析[Fig 2-3]，也可用更準確的有絲分裂和/或凋亡標志物進行分析[Fig 1]。

Fig 1: 細胞周期分析模塊界面

Fig 2. 根據(jù)每個細胞內(nèi)DNA含量-總熒光強度，在2N和4N的雙峰圖中設(shè)定閾值，確定G0/G1，S，G2期。

Fig 3. 單色DNA染料標記下，可根據(jù)每個細胞內(nèi)染色體的聚集度-平均熒光強度，設(shè)定處于分裂期細胞的閾值，確定處于分裂期的細胞，結(jié)合2N/4N參數(shù)，進一步確定分裂早期Early M及晚期 Late M。

        下面的實例中，我們將用陽性化合物處理細胞后，分析其對細胞周期及凋亡狀態(tài)的影響。我們將用軟件中的細胞周期模塊，展示一個集快速、簡單、靈活性為一體的細胞周期及凋亡分析方法。

材料及方法

樣品制備

1. 前列腺癌Du145細胞以8,000/孔接種于96孔板中。
2. 分別將紫杉醇Taxol和星形孢菌素Staurosporine以一定的濃度梯度處理細胞24小時。
3. 將細胞固定，并分別用Hoechst33342（Invitrogen）、anti-phospho Histone H3ser10 （Upstate）（Texas Red 標記二抗） 和anti-cleaved PARP （Cell Signaling） （FITC標記二抗 ）染色。

圖像獲取

1． 使用高內(nèi)涵成像儀器，通過軟件自帶標準Protocol，對96孔板分別用10倍平場半復消色差物鏡和20倍平場半復消色差物鏡全自動獲取圖像。

2． 每孔獲取4個視野圖像。

運用細胞周期模塊對獲取的圖像進行分析

1． 選擇標記DNA的圖像：Hoechst 標記細胞核，反映DNA含量及結(jié)構(gòu)。

2． 設(shè)定細胞核的大小范圍及與背景熒光強度對比值。

3． 設(shè)定分裂期細胞參數(shù)：通過染色標記的DNA強度界定或有絲分裂標志物（anti-phospho Histone H3ser10）界定。

4． 通過凋亡標記物（anti-cleaved PARP）設(shè)定處于凋亡狀態(tài)的細胞。

5． 預覽分析結(jié)果，互動方式調(diào)整分析參數(shù)。

6． 對所有圖像進行自動化分析。

數(shù)據(jù)處理

1． 分析數(shù)據(jù)導入Excel軟件中進行分析。

2． 運用高內(nèi)涵生物信息學軟件對數(shù)據(jù)進行挖掘，包括曲線擬合、IC50/EC50計算及Hit selection等。

Fig 4. 運用細胞周期模塊進行圖像分析，根據(jù)DNA含量及結(jié)構(gòu)對細胞所處的周期狀態(tài)進行分析。分析結(jié)果圖像與原始圖片對比圖： a) 20X  原始圖片， b) 20X 分析圖片， c) 10X原始圖片， d) 10X分析圖片。

Fig 5. 在10倍和20倍物鏡獲取或不同染色標記分析的情況下，藥物處理之后的藥效結(jié)果一致。DNA Avg. Intensity 或 DD 表示運用DNA平均熒光強度界定分裂期細胞。H3s10表示用特異性分裂期標志物 （anti-phospho Histone H3ser10）界定分裂期細胞。 A 表示凋亡Apoptosis， M 表示分裂mitosis。

結(jié)論

1． 細胞周期分析模塊可進行準確的細胞核及細胞狀態(tài)分析

2． 細胞周期分析模塊參數(shù)設(shè)置簡單、操作方面、可通過柱型圖和散點圖互動調(diào)節(jié)參數(shù)。

3． 用10倍和20倍物鏡獲得的最終數(shù)據(jù)，其分析結(jié)果一致。

4． 分別運用DNA熒光強度定義分裂期細胞與分裂期特異性標志物定義分裂期細胞，兩種方法分析結(jié)果一致。