【摘要】 目的 通過(guò)針刺的方法治療阿爾茨海默病模型大鼠,觀察對(duì)其學(xué)習(xí)和記憶的改善效果。方法 通過(guò)給大鼠灌服 D-半乳糖制劑,造成大鼠阿爾茨海默病模型。分別設(shè)立正常組、模型組、藥物組、針刺組、電針組。正常組、模型組只給予相同劑量的生理鹽水灌服,藥物組給予石杉?jí)A甲片(哈伯因)混懸液灌服治療,針刺組采用針刺百會(huì)、神庭、腎俞、太溪、足三里的方法進(jìn)行治療,電針組采用針刺百會(huì)、神庭、腎俞、太溪、足三里穴,并連接電針儀進(jìn)行治療。以 10 d 為 1 個(gè)療程,共治療3 個(gè)療程。通過(guò)大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,并對(duì)大鼠大腦海馬 CA1 區(qū)的 tau 蛋白含量進(jìn)行觀察。 結(jié)果 造模后,正常組大鼠的記憶逃避潛伏期時(shí)間明顯少于模型組(P＜0.05),治療結(jié)束后藥物組、針刺組、電針組的逃避潛伏時(shí)間短于模型組(P＜0.05)。電針組的療效優(yōu)于針刺組和藥物組(P＜0.05)。而治療后,海馬 CA1 區(qū)的 P-tau 蛋白表達(dá)治療組都低于模型組,且電針組的效果要優(yōu)于藥物組和針刺組(P＜0.05)。結(jié)論 運(yùn)用電針能改善阿爾茨海默病模型大鼠的記憶能力,對(duì)阿爾茨海默病有一定的治療作用。 
【關(guān)鍵詞】 針刺;阿爾茨海默病;記憶能力;大鼠 
 
隨著年齡的增大,老年人中癡呆的發(fā)生率逐漸增高,其中以阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)最為多見(jiàn)。這是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦)神經(jīng)細(xì)胞的脫髓鞘式退變。臨床上主要表現(xiàn)為記憶能力、判斷能力、學(xué)習(xí)能力以及行動(dòng)能力、生活自理能力普遍下降,給患者生活質(zhì)量和家庭生活都帶來(lái)了不利的影響。目前尚未有特效藥物和治療方法問(wèn)世,中醫(yī)的針灸治療在臨床上卻收到了較為明顯的改善效果。其中的作用機(jī)制卻未被揭示,本文從神經(jīng)行為學(xué)和組織化學(xué)的層面作了觀察,期望為針刺治療該病的機(jī)制提供佐證。 1 材料與方法 
1.1 材料 
1.1.1 主要器材 
采用由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)的Morris 水迷宮,為改良型水迷宮,其跳臺(tái)可以定時(shí)出現(xiàn)。由日本株式會(huì)社生產(chǎn)的 B50 型天平,由美國(guó) Sigma生物技術(shù)有限公司提供的測(cè)試AD P-tau蛋白的原位雜交試劑盒。中國(guó)江蘇華佗醫(yī)療設(shè)備廠出產(chǎn)的“長(zhǎng)城牌”電針儀。 
1.1.2 主要應(yīng)用試劑 
誘發(fā) AD 模型所用 D-半乳糖由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),藥物組所用藥物為河南竹林眾生制藥有限公司生產(chǎn)的石杉?jí)A甲片(哈伯因)混懸液。 
1.2 動(dòng)物篩選 
將所有購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的Wistar 大鼠放入水迷宮中,進(jìn)行適應(yīng)性的游泳訓(xùn)練,記錄其游泳距離,學(xué)習(xí)逃避潛伏期和學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù),訓(xùn)練 1 星期。然后將游泳能力障礙、學(xué)習(xí)記憶能力先天不足的大鼠予以淘汰,最后選取符合實(shí)驗(yàn)條件的 50 只大鼠進(jìn)入最后實(shí)驗(yàn)程序。 
1.3 模型制備方法 
將準(zhǔn)備造模的大鼠放入相同環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 星期,保持充足的光線、水分和食物。然后按每只大鼠每千克體重 200 mg 的劑量向臍腹部注射 D-半乳糖,每日注射 1 次。一共持續(xù) 6 星期時(shí)間。然后將所有造模大鼠編號(hào),按隨機(jī)原則分為模型組 10 只、藥物組10 只、針刺組 10 只、電針組 10 只。取正常大鼠 10只作為正常組。 
1.4 治療方法 
治療開(kāi)始后,正常組、模型組均給予每日捆綁30 min,并灌服與藥物組灌服藥物相同量的生理鹽水;藥物組則每日灌服石杉?jí)A甲片混懸液 2 mL(17 mg);針刺組則用華佗牌0.30×13 mm針灸針針刺大鼠百會(huì)、神庭、腎俞、太溪、后三里穴,得氣后行針 2 min,留針 30 min;電針組則在針刺組的基礎(chǔ)上接“長(zhǎng)城牌”電針儀,采用疏密波,時(shí)間 30 min。百會(huì)穴在頭頂正中線中點(diǎn)頭骨中央;神庭穴在頭頂正中線前端;腎俞穴在后正中線上,于第二腰椎棘突下旁開(kāi) 1 寸;太溪穴在后肢踝部外側(cè)后方凹陷處;后三里在大鼠后肢膝部外側(cè)前下方。 所有大鼠治療時(shí)間為 6 星期,每日治療 1 次。 
1.5 測(cè)試和取材觀察方法 
跳臺(tái)試驗(yàn)。Morris 水迷宮的游泳池中有一塊橡膠平臺(tái),離水面有 1 cm。將大鼠放入水池中開(kāi)始記時(shí),當(dāng)大鼠通過(guò)游泳尋找到水下的平臺(tái)時(shí)記為學(xué)習(xí)逃避潛伏期。24 h 后再重復(fù)以上試驗(yàn),第 2 次所需時(shí)間為記憶逃避潛伏期。以此作為大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的反應(yīng)指標(biāo)。分別在造模前第 1 星期、治療前第 7 星期、治療后第13星期3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)逃避潛伏期和記憶逃避潛伏期的測(cè)試。 
水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后,將大鼠進(jìn)行麻醉,接著通過(guò)腦過(guò)量灌注致其死亡。將大鼠頭骨切開(kāi)取出大鼠腦組織,放入深度為 4%的 1/1000 DEPC 溶液中保存,再使用多聚甲醛予以固定待檢。將固定的腦組織由額極向枕極順序平均分成 5 份,取出第 2 份腦組織放入 24℃的水中用乙醇進(jìn)行梯度脫水處理。其順序是 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇 1 度、100%乙醇 2 度、100%乙醇 3 度,然后染色切片并用二甲苯使組織透明。用AD P-tau 蛋白原位雜交試劑盒進(jìn)行 tau 蛋白過(guò)度磷酸化陽(yáng)性檢測(cè)。細(xì)胞中出現(xiàn)的棕黃色顆粒者即為過(guò)度磷酸化 tau 蛋白表達(dá)。最后對(duì) tau 蛋白陽(yáng)性表達(dá)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 
用電子計(jì)算機(jī)編輯圖像和表格。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料的表示方式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,用方差來(lái)分析組與組之間的均數(shù)對(duì)比,以P ＜0.05 為衡量標(biāo)準(zhǔn)。在對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的觀察時(shí)每個(gè)載玻片取 3 個(gè)視野,計(jì)取其平均顆粒數(shù)。 
 2.1 大鼠的一般情況 
正常組的大鼠體力充沛,反應(yīng)靈敏,動(dòng)作迅捷,毛色光澤,飲食、排便情況正常。 造模組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神疲乏力,反應(yīng)遲笨,行動(dòng)萎鈍,體力差,毛色粗糙,飲食量差,排便少或便質(zhì)稀溏。這種情況自造模后開(kāi)始呈現(xiàn),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 
2.2 大鼠行為學(xué)指標(biāo)觀察結(jié)果 
從表 1 可以看出,造模前各組大鼠的學(xué)習(xí)逃避潛伏時(shí)間大致相等,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);治療前(即造模 6 個(gè)月后),各造模組大鼠學(xué)習(xí)逃避潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng),與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠學(xué)習(xí)能力有所下降,具備AD 初步特征。治療后,即第 13 星期,各治療組大鼠的學(xué)習(xí)逃避潛伏時(shí)間又比模型組明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),說(shuō)明經(jīng)過(guò)針刺或藥物治療,AD 大鼠學(xué)習(xí)能力有了一定的恢復(fù)。而電針組的情況更為樂(lè)觀,與其他治療組相比,學(xué)習(xí)逃避潛伏時(shí)間縮短更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。從表 2 可以看出,造模前各組大鼠的記憶逃避潛伏時(shí)間大致相等,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);治療前(即造模 6 個(gè)月后),各造模組大鼠記憶逃避潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng),與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠記憶能力有所下降,具備AD 初步特征。治療后,即第 13 星期,各治療組大鼠的
記憶逃避潛伏時(shí)間又比模型組明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),說(shuō)明經(jīng)過(guò)針刺或藥物治療,AD 大鼠記憶能力有了一定的恢復(fù)。而電針組的情況更為樂(lè)觀,與其他治療組相比,記憶逃避潛伏時(shí)間縮短更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 
3 討論 
許多研究都充分地證實(shí),人對(duì)空間結(jié)構(gòu)的學(xué)習(xí)能力和記憶能力更多地建立在大腦組織中的海馬神經(jīng)元,而 AD 則是對(duì)該區(qū)的腦組織造成持續(xù)性的神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變而使空間學(xué)習(xí)和記憶能力下。學(xué)習(xí)和記憶能力作為癡呆患者智力指標(biāo)的重要考查要點(diǎn),具有金指標(biāo)的指示地位,所以在實(shí)驗(yàn)中我們把大鼠的學(xué)習(xí)、記憶逃避潛伏期作為觀察指標(biāo)
。以上的結(jié)果清楚地表明,經(jīng)過(guò)腹腔灌服 D-半乳糖后,AD 模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力已經(jīng)是明顯退化了,說(shuō)明 D-半乳糖的吸收可以造成大鼠大腦細(xì)胞退行性改變,tau
蛋白等負(fù)面物質(zhì)的產(chǎn)生,使大腦功能退化。然而通過(guò)針刺后,大鼠在水迷宮的表現(xiàn)令人欣慰,雖然在治療的 6星期期間,大鼠的腦細(xì)胞仍然處于退變狀態(tài),但潛伏時(shí)間并沒(méi)有下降得很快,甚至電針組還有所提升,實(shí)驗(yàn)證實(shí),針刺治療能夠與西藥一樣起到改善腦部功能的作用。經(jīng)過(guò)治療,大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力都較治療前有回升。當(dāng)然,由于 AD 不僅是功能變化,也有一部分器質(zhì)上的改變,所以針刺只能在一定范圍內(nèi)起到治療恢復(fù)的作用,而不能使 AD 大鼠的記憶功能完全恢復(fù),但是實(shí)驗(yàn)也顯示,電針相對(duì)于普通針刺更有效,說(shuō)明如果對(duì)針刺手法和方式進(jìn)行改進(jìn),能夠進(jìn)一步擴(kuò)大療效,使治療后效果無(wú)限接近于正常。從生物化學(xué)層面分析,tau 蛋白過(guò)量產(chǎn)生,對(duì)腦功能是一種負(fù)面影響,藥物組和針刺
組都不同程度地達(dá)到抑制該蛋白產(chǎn)生的目的。而電針能更有效地降低 tau 蛋白的表達(dá)率,一方面說(shuō)明了 tau的確對(duì)大鼠記憶系統(tǒng)造成紊亂,另一方面也提示如果能降低 tau 蛋白的表達(dá),那么就能一定程度地改善大腦功能。