β-AP對(duì)衰老模型大鼠開場(chǎng)行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

　　摘要:用D-半乳糖(D-gal) 建立衰老動(dòng)物模型且海馬內(nèi)微注射βAP ,檢測(cè)各組大鼠開場(chǎng)行為、Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)和一次性被動(dòng)回避反應(yīng)的變化的方法,研究β-淀粉樣蛋白(βAP) 對(duì)衰老大鼠開場(chǎng)行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響. 結(jié)果是D-gal + NS 組、D-gal +βAP 組大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)活動(dòng)和探究行為減少,學(xué)習(xí)記憶減退,與NS + NS 組比較有顯著性差異( P < 0. 05 , P < 0. 01) . 該文得出的結(jié)論是βAP 與D-gal 聯(lián)合使用可導(dǎo)致腦老化程度加重,學(xué)習(xí)記憶能力顯著減弱.

關(guān)鍵詞:β-淀粉樣蛋白; 開場(chǎng)行為; 學(xué)習(xí)記憶; 衰老

　　β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein ,βAP) 是老年性癡呆患者的大腦中特有的一種蛋白,它在老年性癡呆的發(fā)病機(jī)理中的作用已引起人們的重視. 生化研究表明,β-淀粉樣蛋白是老年性癡呆患者腦海馬和皮層老年斑(SP) 的主要成分,它與AD 的病理形成過(guò)程關(guān)系密切. 已有報(bào)道βAP 對(duì)正常大鼠海馬神經(jīng)元的毒害作用[1 ,2 ] ,但有關(guān)βAP 對(duì)衰老大鼠的作用,國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)試圖在D-半乳糖所致衰老動(dòng)物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行海馬內(nèi)注射βAP ,觀察其對(duì)大鼠開場(chǎng)行為和空間分辨學(xué)習(xí)以及記憶保持能力的影響.

1 　材料與方法

1. 1 　動(dòng)物和試劑

雄性健康SD 大鼠,體重100～120 g,βAP 為Sigma 公司產(chǎn)品(βAP1 -40 ,Lot NO.76H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 為上海試劑二廠產(chǎn)品.

1. 2 　分組和模型建立

將大鼠隨機(jī)分成4 組: ①生理鹽水NS + NS組; ②NS +βAP 組; ③D-gal + NS 組; ④D- gal +βAP組. ③、④組動(dòng)物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg - 1·d - 1 ,連續(xù)注射6 周建立衰老動(dòng)物模型[3 ] ; ①、②組動(dòng)物腹腔注射等量生理鹽水. 于第4 周進(jìn)行雙側(cè)海馬內(nèi)注射βAP , 每側(cè)注射1μL (4μg/μL) ;對(duì)照組注射等量生理鹽水. 海馬定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥鈉(40 mg. kg - 1) 麻醉,立體定位儀(日本NARISHIGE SN - 3 型) 上固定,坐標(biāo)按照?qǐng)D譜[4 ] ,以前囪定位:AP = - 3. 5 mm ,ML = ±2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,鉆開顱骨,用微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針,每側(cè)注射時(shí)間為5min ,留針5min ,緩慢起針,局部消毒后縫合皮膚,肌注抗生素抗感染.

1. 3 　行為學(xué)檢測(cè)

連續(xù)腹腔內(nèi)注射6 周后進(jìn)行.

1. 3. 1 　開場(chǎng)行為(open field) [5 ] :

將動(dòng)物置于圓形開場(chǎng)檢測(cè)箱底中央的格內(nèi),記錄其在3 min 跑動(dòng)(locomotion) 穿過(guò)的格數(shù),后肢站立( rearing) 次數(shù)、梳理(groo ming) 次數(shù)及糞便顆粒數(shù). 比較不同組間大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)行為和探究行為表現(xiàn)的差異.

1. 3. 2 　Y - 迷宮分辨學(xué)習(xí)( Y-maze discri minationlearning) 能力檢測(cè)[6 ] :Y-迷宮為三等分輻射式反射箱. 以大鼠被電擊后逃至安全區(qū)為一次正確反應(yīng),連續(xù)10 次測(cè)試中有9 次(90 %) 正確反應(yīng),定為學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn). 記錄每個(gè)大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)的訓(xùn)練次數(shù). 所有檢測(cè)過(guò)程均由計(jì)算機(jī)完成.

1. 3. 3 　一次性被動(dòng)回避反應(yīng)(one- t rial passiveavoidance response) [5 ] :

根據(jù)大鼠趨暗習(xí)性,記錄其在通道上的停留時(shí)間,即步入潛伏期(step- through latency , STL) ;動(dòng)物進(jìn)入暗箱后立即給予電擊(0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后檢測(cè)大鼠的STL. 以STL 作為記憶保持的指標(biāo),STL越長(zhǎng)表明對(duì)電擊的記憶保持越好. 檢測(cè)以240 s 為限.本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用( X ±S .X ( X 表示,組間差異用t檢驗(yàn);一次性被動(dòng)回避反應(yīng)采用Mann-whitney 非參數(shù)檢驗(yàn).

2 　結(jié)　　果

2. 1 　不同組大鼠開場(chǎng)行為觀察

結(jié)果見表1，統(tǒng)計(jì)處理表明,在開場(chǎng)行為諸參數(shù)中,D-gal +βAP 組動(dòng)物與NS + NS 組比較糞便顆粒數(shù)有顯著性差異( P < 0. 05) ,而跑動(dòng)格數(shù)則極明顯減少( P < 0. 01) ,前者在新異環(huán)境中自發(fā)活動(dòng)和探究反應(yīng)明顯下降,緊張恐懼狀態(tài)也降低. D-gal + NS組動(dòng)物跑動(dòng)格數(shù)與NS + NS 組比較也有顯著性差異( P < 0. 05) . NS + NS 組與NS +βAP 組之間雖無(wú)顯著性差異,但其跑動(dòng)格數(shù)、站立次數(shù)均有下降趨勢(shì),說(shuō)明βAP 單獨(dú)使用對(duì)大鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)及探究行為也有一定影響.

表1 　β-淀粉樣蛋白對(duì)大鼠開場(chǎng)行為的影響

組別             n      跑動(dòng)格數(shù)         后肢站立次數(shù)     糞便顆粒數(shù)

NS + NS      10  86. 6 ±7. 5        23. 6 ±2. 3     4. 0 ±1. 9

NS +βAP      9   73. 8 ±9. 6        20. 3 ±3. 1     3. 1 ±2. 0

D-gal + NS   9   69. 3 ±9. 8^*      18. 8 ±1. 9     3. 0 ±1. 6

D-gal +βAP  9   46. 7 ±5. 8^**△  15. 7 ±2. 2     1. 3 ±0. 2^*

*P < 0. 05 , **P < 0. 01 vs NS + NS group ,

△P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

2. 2 　Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)能力檢測(cè)

達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù),NS + NS 組:21. 4 ±2. 6 ;NS +βAP 組:34. 6 ±5. 5 ;D-gal + NS 組:42. 4 ±5. 4 ;D-gal +βAP 組:48. 0 ±5. 6. 前兩者比較無(wú)顯著性差異( P > 0. 05) ,D-gal + NS 組與NS + NS組比較有顯著性差異( P < 0. 05) ,而D-gal +βPA 組與NS + NS 組比較,達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)極明顯增加( P < 0. 01) ,說(shuō)明D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨學(xué)習(xí)能力顯著降低,而在衰老動(dòng)物模型上海馬內(nèi)注射βAP 更使學(xué)習(xí)能力極顯著下降.

2. 3 　一次性被動(dòng)回避反應(yīng)

從表2 可見D-gal +βAP 組記憶保持能力明顯下降,電擊后24 hSTL 顯著縮短,與NS + NS 組和D- gal + NS 組比較有顯著性差異( P < 0. 05) . 其他組之間比較,差異無(wú)顯著性,但記憶保持能力呈逐漸降低趨勢(shì).

表2 　β-淀粉樣蛋白對(duì)大鼠步入行為的影響

                     STL (s)

 組　別           電擊前            電擊后24 h

                 中位數(shù)    四分位數(shù)   中位數(shù)     四分位數(shù)

NS + NS       24      10 - 35      216      73 - 240

NS +βAP       25      10 - 29     152       15 - 240

D-gal + NS   23       20 - 34     188       55 - 240

D-gal +βAP   33       22 – 77    108^*△   58 - 240

*P < 0. 05 vs NS + NS group. △P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

3 　討　　論

有研究報(bào)道,對(duì)大鼠連續(xù)注射D-半乳糖引起擬衰老效應(yīng)[7 ] ,可導(dǎo)致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降,腦內(nèi)超氧陰離子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD) 活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 這說(shuō)明D-半乳糖誘發(fā)的自由基蓄積引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,是產(chǎn)生擬衰老變化的原因,這必然也會(huì)引起衰老性腦功能的衰退.βAP 是老年性癡呆患者最早出現(xiàn)的典型的病理學(xué)特征. 一些學(xué)者認(rèn)為,βAP 可引起學(xué)習(xí)記憶減退、認(rèn)知障礙等[8 ] ,是AD 各種病理和臨床表現(xiàn)的始發(fā)因素. βAP 具有沉積作用和神經(jīng)毒性,較高濃度的βAP 能引起神經(jīng)退化和死亡[1 ] ;βAP 的神經(jīng)毒性作用可以增強(qiáng)或加大各種傷害性刺激的細(xì)胞損傷效應(yīng),此外它還具有直接的細(xì)胞毒性[9 ] . 但Morimoto報(bào)道,在大鼠海馬神經(jīng)元,單獨(dú)注射βAP 不能產(chǎn)生特定的神經(jīng)毒性作用,僅能引起少量的神經(jīng)元變性[10 ] . 無(wú)論在體外培養(yǎng)細(xì)胞,還是在體內(nèi)研究中,βAP 是否具有神經(jīng)毒性作用還存在著爭(zhēng)議,其原因可能是所用βAP 的濃度不同所致[11 ] . 本研究結(jié)果表明海馬內(nèi)單獨(dú)注射βAP 不能引起明顯的行為學(xué)變化,但在衰老動(dòng)物模型基礎(chǔ)上經(jīng)βAP 處理后,可導(dǎo)致動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶行為明顯降低,說(shuō)明D-半乳糖和βAP 有疊加效應(yīng). 學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)功能,學(xué)習(xí)記憶減退是腦功能衰退的表現(xiàn). 因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在D-半乳糖所致衰老動(dòng)物基礎(chǔ)上,海馬內(nèi)注射βAP ,可望作為更接近AD 的一種動(dòng)物模型. 但它是否具有AD 的各種病理學(xué)特征,還有待于做進(jìn)一步研究。

 

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