α7nACh 受體的競爭性拮抗劑對實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

摘要:目的　探討α7nACh 受體的競爭性拮抗劑(MLA) 對實(shí)驗(yàn)小鼠在Morris 水迷宮中學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

方法　雄性昆明小鼠每天腹腔注射MLA (110、418μg/ g ) ,連續(xù)8d ,采用Morris 水迷宮,通過定位航行、空間探索試驗(yàn)觀察分析小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果　小鼠腹腔注射MLA 418μg/ g 與其余三組相比,尋找平臺潛伏期明顯延長( P < 0101) ,在目標(biāo)象限游泳時間所占百分比也明顯降低( P < 0101) ,結(jié)論　腹腔注射MLA 418μg/ g的小鼠有學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。

關(guān)鍵詞:α7nACh 受體的競爭性拮抗劑;Morris 水迷宮;學(xué)習(xí)記憶能力;小鼠

　　α7nACh 受體的競爭性拮抗劑是燕草屬植物飛燕草子(Delphinium spp1) 的提取物甲基牛扁亭(methyllycaconitine ,MLA) ,為一種植物毒素[1 - 2 ] 。近年來的動物實(shí)驗(yàn)研究表明, MLA 通過對α7nACh 受體的競爭性拮抗, 導(dǎo)致動物認(rèn)知功能障礙[3 - 4 ] 。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射法, 用Morris 水迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力, 擬建立一種模擬α7nACh 受體損傷的癡呆模型, 以進(jìn)一步為研究α7nACh 受體在阿爾茨海默病等退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用機(jī)理和針對治療α7nACh 受體損傷的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 　材料和方法

111 　實(shí)驗(yàn)動物和分組　選用健康雄性3 個月齡昆明小白鼠(購自寧夏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心) 85 只,隨機(jī)選取35 只用于確定最大逃逸潛伏期實(shí)驗(yàn),其余50 只,在正式開始實(shí)驗(yàn)的前一天,小鼠依次在Morris 水迷宮中自由游泳2min ,選取游泳姿勢和速度符合要求的小鼠40 只,隨機(jī)分為4 組,每組各10 只。1) 正常對照組:小鼠自由進(jìn)食飲水,自然晝夜節(jié)律光照;2) 生理鹽水組:注射等量生理鹽水;3) 110μg/ g組:每天注射MLA 110μg/ g ,連續(xù)8d ;4) 418μg/ g 組:每天注射MLA 418μg/ g ,連續(xù)8d。

112 　試劑和儀器　MLA:粉劑,購自Sigma 公司。Morris 水迷宮及微機(jī)生物機(jī)能系統(tǒng),購自成都泰盟科技有限公司。

113 　MLA 溶液制備及給藥劑量　臨用前將110μg/ g 和418μg/ g 的MLA 分別溶解于生理鹽水中,按011mL/ 10g 的

劑量連續(xù)注射8d。

114 　Morris 水迷宮行為測定　水迷宮為圓形水池,池壁為乳白色,壁上標(biāo)有東、南、西、北四個入水點(diǎn),將水池等分為SW、MW、SE 及NE 四個象限,在SW象限正中放圓形透明平臺,平臺頂?shù)陀谒��?cm ,水溫(26 ±1) ℃,水中加入適量牛奶,至看不清水下平臺。迷宮正上萬懸掛攝像機(jī)并連接計算機(jī)等記錄顯示系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜,迷宮外參照物(如門、窗、冰箱、電燈) 等保持不變。

11411 　最大逃逸潛伏期的確定:選取的35 只小鼠,分上、下午兩個時段進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,每個時段訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練時小鼠先自由游泳2min ,適應(yīng)環(huán)境后將小鼠面向池壁放入水中,記錄每次從入水點(diǎn)至找到平臺的最大時限。訓(xùn)練時操作者隨機(jī)選擇一個入水點(diǎn),但在同一個訓(xùn)練時段內(nèi),每只小鼠的入水點(diǎn)相同。120s 內(nèi)找不到平臺,將小鼠引導(dǎo)至平臺上休息10s ,連續(xù)2d ,記錄找到平臺的時間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,

選取90 %以上小鼠找到平臺的時間,確定為最大逃逸潛伏期。

11412 　注射MLA 動物定位航行試驗(yàn)(place navigation) :將篩選并分組的小鼠,從第1 天起,按11411 方法訓(xùn)練5d ,記錄潛伏期及游泳速度,取后3d 的算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。注射MLA 后按同樣的方法繼續(xù)訓(xùn)練,連續(xù)8d ,取8d 的算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

11413 　注射MLA 動物空間搜索試驗(yàn)( spatial probe test) :在訓(xùn)練第5d 和注射MLA 8d 后,撤除水下平臺,于平臺象限池壁中點(diǎn)為入水點(diǎn),記錄小鼠120s 內(nèi)搜尋平臺在各象限的游泳時間。

115 　統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用(.x ±s) 表示,采用單因素方差分析(Oneway ANOVA) ,方差齊性時,用LSD(Le Significant Difference)或Student Newman Keuls 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,方差不齊時,用秩和檢驗(yàn),組間比較Kruskal Wallisttest。采用SPSS 1110 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 　結(jié)果

211 　最大潛伏期測定結(jié)果　35 只小鼠中,2 只原地打轉(zhuǎn),

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Journal of Ningxia Medical College

第28 卷　3 期

　2006 年6 月

不符合實(shí)驗(yàn)要求被剔除。33 只小鼠中有31 只經(jīng)2d (16 次)訓(xùn)練,能夠在第16 次訓(xùn)練后70s 以內(nèi)找到平臺,超過總數(shù)

的90 % ,因此,確定最大潛伏期為70s。

212 　注射MLA 動物定位航行試驗(yàn)

21211 　逃逸潛伏期:訓(xùn)練5d 后,各組與正常對照組逃逸潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0105) ; 注射MLA 后,

418μg/ g 組和正常對照組比較逃逸潛伏期明顯延長,有統(tǒng)計學(xué)意義( P < 0101) ,其余各組與正常對照組比較逃逸潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0105) ,見表1。

21212 　游泳速度:訓(xùn)練5d 后和注射MLA 后,實(shí)驗(yàn)各組與正常對照組速度比較無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0105) ,提示注射生理鹽水和MLA 后小鼠的運(yùn)動能力沒有受到影響(表1) 。

 

表1 　各組小鼠定位航行試驗(yàn)尋找隱匿平臺的平均潛伏期和平均速度

組別                     潛伏期(s)                            游泳速度(cm/ s)

訓(xùn)練5d             注射MLA 8d            訓(xùn)練5d               注射MLA 8d

正常對照          33.03 ±1.61           18.46 ±1.41          12.42 ±1.92            11.05 ±1.19

生理鹽水          32.68 ±4.99           17.11 ±1.45          11.12 ±1.29            11.84 ±4.03

MLA 110μg/ g      31.54 ±4.99           15.11 ±1.46          13.09 ±3.21            10.56 ±1.59

MLA 418μg/ g      29.65 ±5.34           47.95 ±9.313            11.21 ±1.35             10.13 ±0.59

　與對照組潛伏期比較3 P < 0101

213 　注射MLA 動物空間搜索試驗(yàn)　訓(xùn)練至第5d ,各組與正常對照組平臺象限停留時間百分比比較無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0105) ;注射MLA 后,418μg/ g 組和正常對照組平臺象限停留時間百分比比較有統(tǒng)計學(xué)意義( P < 0101) ,其余各組與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0105) ,見表2。

 

 

表2 　各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)在目標(biāo)

組別                      平臺象限停留時間百分比( %)

訓(xùn)練5d                    注射MLA 8d

正常對照              45.12                         47.61

生理鹽水              49.52                         45.33

MLA 110μg/ g          41.87                         45.62

MLA 418μg/ g          41.23                         29.98*

　與對照組比較*P < 0101

3 　討論

隨著學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的不斷深入,以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類疾病方法的需要,客觀準(zhǔn)確地評價實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶水平已經(jīng)成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常重要的研究內(nèi)容。Morris 水迷宮是英國心理學(xué)家Morris 于20 世紀(jì)80 年代初設(shè)計的,主要應(yīng)用在學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制探討和神經(jīng)藥理(包括中藥藥理) 的研究[5 ] 。但Morris 使用這一迷宮測試方法所針對的對象是大鼠,經(jīng)過查閱資料發(fā)現(xiàn)亦有將之應(yīng)用于小鼠的,但訓(xùn)練方法有所不同[6 - 8 ] ,在我們的測試中,訓(xùn)練為5 d ,分上、下午兩個時段,每段訓(xùn)練4 次,實(shí)驗(yàn)至第3 天基本穩(wěn)定,提示Morris 水迷宮也適用于小鼠的記憶行為測試。測試35 只小鼠,將最大潛伏期確定為70s ,在本實(shí)驗(yàn)中是比較合適的,既排除了因訓(xùn)練時間不同,而造成小鼠記憶能力的差異,也節(jié)省了時間,確保實(shí)驗(yàn)的完成。但由于訓(xùn)練的工作量大,工作人員少,測試的樣本量較少,對于更準(zhǔn)確地確定小鼠的最大潛伏期合適范圍還需要進(jìn)一步的研究。Morris 水迷宮的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為復(fù)雜,其統(tǒng)計分析難度也較大,尤其是小鼠在定位航行中所測得的逃避潛伏期如何進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析既往存在的問題較多。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)正常對照組的小鼠,通過5d 的訓(xùn)練期和8d 測試期,逃逸潛伏期逐漸減少,但在訓(xùn)練2d 后基本趨于穩(wěn)定,因此,取后3d 的平均逃避潛伏期作為平均訓(xùn)練潛伏期進(jìn)行統(tǒng)計分析。a7nACh 受體在阿爾茨海默病(AD) 的早期就有缺失,認(rèn)為是AD 的早期癥狀,因此人們開始試圖以a7nACh 受體為靶點(diǎn),研究其結(jié)構(gòu)、分布和功能與AD 的關(guān)系。但由于神經(jīng)元煙堿受體( nAChR) 亞型之間差別很小,數(shù)量又很多,就α7nACh 受體亞型也不僅有種屬差異,而且隨年齡的變化而有改變,因此,要尋找α7nACh 受體亞型特異性拮抗劑或激動劑是非常艱難的,雖然近年來在合成競爭性特異性激動劑方面取得一些進(jìn)展[9 ] ,但具有高親和性特異性高的拮抗劑還是很少的,目前僅有a -bungarotoxin[10 ]和a - conotoxinI2mI and methyllycaconitine(MLA) [11 ] 。MLA 對哺乳類動物的神經(jīng)型a7nACh 受體的親和性比其它煙堿受體都要高。本實(shí)驗(yàn)中腹腔注射MLA 110 、418μg/ g 后,發(fā)現(xiàn)MLA 對小鼠的記憶有損害,且有劑量依賴性,提示可以通過選擇適當(dāng)劑量的MLA ,擬建立一種模擬a7nACh 受體靶點(diǎn)損傷的動物模型,為進(jìn)一步研究α7nACh受體在AD 等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的作用機(jī)理和針對治療α7nACh 受體損傷的藥物開發(fā)提供依據(jù)。