Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,

Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b

a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany

b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany

Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006

Available online 17 January 2007

    我們運用多焦點雙光子激光掃描顯微鏡來進行局部和選擇性的蛋白激活以及細胞內(nèi)蛋白動態(tài)的的量化調(diào)查。局部激活使用光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)和光學(xué)雙光子激發(fā)來實現(xiàn)，以調(diào)查實時原位的細胞內(nèi)動態(tài)。這個過程對于深入理解和建模活細胞內(nèi)的調(diào)控和代謝過程極其重要。作為范例，既包含了一個核輸入信號又包含了一個核輸出信號的擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子LHY/CCA1-like 1 (LCL1)被定量化調(diào)查。我們使用了由質(zhì)粒編碼的光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)融合蛋白和一個紅色熒光轉(zhuǎn)染標記聯(lián)合轉(zhuǎn)染的煙草BY-2原生質(zhì)體，并pa-GFPLCL1在核內(nèi)光激活后的快速向核外輸出。作為對照，一個LCL1核輸出陰性突變體仍然被束縛在核內(nèi)。我們確定了由激活pa-GFP-LCL1的雙向核運輸和pa-GFP的擴散分別導(dǎo)致的核內(nèi)熒光下降的51s和125s的平均時間常數(shù)

    Pa-GFP的激活和熒光的原位檢測，通過基于根據(jù)蛋白動態(tài)監(jiān)測需求改進的商業(yè)化系統(tǒng)(TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001)多焦點2光子LSM檢測(Fig. 1). 64焦點2光子LSM (Martini et al., 2006)包括一個倒置光學(xué)顯微鏡和一個可以產(chǎn)生從760nm到960nm的100fs激光脈沖的由固態(tài)激光器泵浦的鎖模飛秒Ti:Sa激光器。用于激活和成像循環(huán)的波長選則通過一個允許5s內(nèi)轉(zhuǎn)換波長的ahome-built screw motorization來實現(xiàn)。

    激光掃描單元(TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一個內(nèi)置的預(yù)啁啾部分以補償激光脈沖的色散，一個光束分光器部分和振鏡掃描器。通過選擇一組10個100%反光鏡和50%分光鏡，激發(fā)的NIR激光束在樣品中被分為1, 2, 4,……, 64個激發(fā)焦點。這些數(shù)目可調(diào)的焦點在顯微鏡物鏡(UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus)的焦平面上被激光掃描單元中的2個掃描鏡掃描。整個激活和測量過程在一個溫度可控環(huán)境中在293±1K下進行。因為在保持每個焦點的能量沉積低于樣品的退化極限的同時，多個焦點產(chǎn)生了相對高的雙光子誘導(dǎo)熒光產(chǎn)額，成像可以30ms的時間分辨率進行。圖像用一個背照明的EMCCD相機(IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology)以non-descanned方式獲取。激發(fā)的NIR激光束被引導(dǎo)通過一個分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma)到物鏡的后光圈上。為了成像深度和光譜熒光切片，倒置顯微鏡采用了機械聚焦驅(qū)動(MFD, Marzhauser)和一個程序控制濾波輪(LaVision-BioTec)。數(shù)據(jù)獲取和實驗控制由 TriM Scope的軟件包Imspector(LaVision-BioTec)執(zhí)行。操作和處理5維的數(shù)據(jù)列，包括光譜和時間數(shù)據(jù)軸，使用軟件包Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).

Fig. 1.多焦點2光子激光掃描顯微鏡的原理圖(1) Tsunami Ti:Sa 激光器(波長可調(diào))由固態(tài)Millenia X 激光器泵浦 (均來自 Spectra Physics), (2) 多焦點激光掃描單元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通過濾波輪 (2光子-Emitter, Chroma), (5) 物鏡 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 樣品中可選擇數(shù)目的熒光焦點, (7) 倒置光學(xué)顯微鏡(IX 71, Olympus), (8) 濾波輪 (濾波輪, LaVision BioTec)裝備帶通濾波片 D 605/55 (Chroma)用于檢測 Ds-Red 和 HQ525/50 結(jié)合 HQ510/20 (均來自 Chroma)以檢測 pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在NDD光路中, (10) 熒光燈 (HBO 50, Zeiss), (11) 帶通激發(fā)濾波輪 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或帶通激發(fā)濾波輪HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.

Fig. 2.含有核輸入輸出信號的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子LCL1 (分別為NLS, NES). 由質(zhì)粒編碼GFP融合蛋白轉(zhuǎn)染的煙草BY-2原生質(zhì)體。通過單光子共聚焦激光掃描顯微鏡分析的GFP融合蛋白穩(wěn)定態(tài)定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核與細胞質(zhì)間的分區(qū)

 (b) 使用核輸出抑制劑leptomycin B (LMB)孵育后，由于功能性NLS的存在，GFP-LCL1的穩(wěn)定態(tài)分區(qū)劇烈轉(zhuǎn)化為幾乎完全分布于核中。 (c,d) 對照，LMB對單獨的GFP沒有影響。 (e) GFPLCL1(NESm)中，它的NES的點突變造成的LCL1的核輸出活性削弱同樣導(dǎo)致了GFP融合蛋白在核內(nèi)的聚集。(f) 與(e)中同一個原生質(zhì)體的透射光與GFP熒光成像的疊加標尺為10um (g) 作為對照的 GFP-NLS 在核內(nèi)的增加。 (h) 同一原生質(zhì)體的GFP-NLS綠色熒光蛋白和作為轉(zhuǎn)染標記的Pra1-DsRed (At2g38360)紅色熒光蛋白的疊加。

Fig. 3. pa-GFP 在一個活原生質(zhì)體內(nèi)的自由動態(tài)擴散。選出的5幅表達pa-GFP的煙草BY-2原生質(zhì)體的單光子透射熒光圖像。(a)實驗開始，未激活 (b) pa-GFP的雙光子激活期間 (c–e) 雙光子激活后，所示時間點。(a)核內(nèi)（紅虛線）的pa-GFP在雙光子激發(fā)前平均熒光很難被檢測到。使用4個平行焦點(10mW at 800 nm 每焦點)的持續(xù)3s的飛秒激光對一個7X8um的區(qū)域進行pa-GFP 2光子激發(fā)開始 (b) 激發(fā)后很短時間內(nèi)檢測到一個強的熒光信號(c–e) pa-GFP從核內(nèi)向細胞質(zhì)的擴散被監(jiān)測，直到兩組分間達到平衡。熒光強度標尺顯示在每幅圖的左邊。

Fig. 4.在核內(nèi)被光激活后，pa-GFP從核內(nèi)向細胞質(zhì)擴散的量化分析。在激活前，核內(nèi)（ROI）平均的1光子熒光強度非常低（平均強度～300）.在26s和29s間的時間點，由飛秒激光激活誘導(dǎo)的熒光增強在圖上進行了監(jiān)測。 與光激活前相比，平均熒光強度是之前的大約5倍，伴隨著ROI內(nèi)的熒光降低。在個地方，監(jiān)測到的細胞核內(nèi)熒光下降是由于激活的pa-GFP向細胞質(zhì)內(nèi)的擴散。后來，光漂白變得顯著。雙指數(shù)擬合非常近似地擬合了整個熒光下降過程（紅線）。以此方式計算出這個實驗中175s的擴算時間常數(shù)。

Fig. 5. 煙草BY-2原生質(zhì)體中At2g38360-DsRed的定位和平行雙光子熒光顯微鏡對pa-GFP的3D監(jiān)測（64 foci, 920 nm, 240 mW)。 (a) 雙光子熒光下降的量化分析，給出了一個123s的擴散時間常數(shù)。Figs. 3 and 4中的數(shù)據(jù)源于兩個不同的實驗，解釋了熒光值的絕對差異（不同的表達水平）和統(tǒng)計分析。 (b) At2g38360-DsRed作為轉(zhuǎn)染標記在核中pa-GFP激活前的熒光 (c) At2g38360-DsRed和pa-GFP數(shù)據(jù)采集后400 s的3D熒光圖像，清楚顯示了熒光團從細胞核向細胞質(zhì)的擴散。

Fig. 6.在核內(nèi)光激活前后,煙草BY-2原生質(zhì)體內(nèi)活躍轉(zhuǎn)運的pa-GFP-LCL1的3D動態(tài)監(jiān)測和量化分析。(a) 在pa-GFP-LCL1雙光子激發(fā)后核內(nèi)的單光子熒光表明雙光子激活熒光增強 (b) pa-GFP被雙光子激活后雙指數(shù)曲線擬合（紅線）的熒光下降量化分析。計算得出的由于主動運輸導(dǎo)致的核內(nèi)pa-GFP-LCL1熒光下降的一個20s的時間常數(shù)(c,d) At2g38360-DsRed（轉(zhuǎn)染標記）和pa-GFP-LCL1的雙色雙光子熒光3D成像 (c)核內(nèi)光激活前 (d)數(shù)據(jù)獲取后

Fig. 7. 煙草BY-2原生質(zhì)體的核輸出陰性突變pa-GFP-LCL1(NESm)光激活前后的3D動態(tài)監(jiān)測和量化分析。(a) pa-GFP-LCL1(NESm)被雙光子激活后的單光子熒光顯示了雙光子激活熒光增強和激活后核內(nèi)熒光極其緩慢的下降，反映了pa-GFPLCL1(NESm)的核限制 (b,c) At2g38360-DsRed (轉(zhuǎn)染標記) 和 pa-GFP-LCL1(NESm) 的雙光子熒光3D圖像 (b) 光激活前的核內(nèi) pa-GFP (c) 數(shù)據(jù)獲取后300s的時間點