賈偉  沃特世科技（上海）有限公司實(shí)驗(yàn)中心

 

在生物藥肽圖分析、蛋白質(zhì)修飾分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等諸多工作中，蛋白質(zhì)的變性與酶解是樣品處理的必經(jīng)之路。RapiGestTM SF正是在這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中，用以輔助蛋白酶解的變性試劑[^1,2,3]。RapiGest SF有以下優(yōu)點(diǎn)：

■ 綜合水相、有機(jī)相溶液條件下，最高效的輔助酶解變性劑。

■ 作用過程中，不對(duì)蛋白造成副反應(yīng)化學(xué)修飾。

■ 操作簡單、全面適應(yīng)液質(zhì)分析方法。

■ 常規(guī)操作濃度對(duì)胰蛋白酶活性無抑制。

■ 可大大縮短酶解反應(yīng)時(shí)間。

■ 對(duì)各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用。

 

在蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的大部分工作中，常常需要將蛋白質(zhì)酶解為多肽進(jìn)行分析。但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是以三維結(jié)構(gòu)的形式存在的，為了將蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酶切位點(diǎn)暴露于蛋白酶的作用下，首先需要對(duì)蛋白進(jìn)行變性，使蛋白舒展開。John R. Yates教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)對(duì)各種變性劑中的輔助酶切效果進(jìn)行了充分比較，其中RapiGest SF的表現(xiàn)最為優(yōu)秀（圖1）^[4]。仔細(xì)觀察圖1還可以發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，較為常用的尿素輔助酶切效率較差。這是由于尿素對(duì)胰蛋白酶活性的抑制作用較大。實(shí)驗(yàn)人員有時(shí)會(huì)采取使用尿素進(jìn)行蛋白后，將反映溶液稀釋10倍，再加入胰蛋白酶的方法，以降低尿素濃度到1M以下，減少其對(duì)胰蛋白酶的抑制。但是，面對(duì)微量的生物蛋白樣本，稀釋后的體系，會(huì)大幅度降低樣品濃度，限制了后續(xù)的分析工作。此外，尿素在對(duì)蛋白變性的過程中，還會(huì)對(duì)蛋白進(jìn)行一定的化學(xué)修飾，如氨基甲酰化。副反應(yīng)的發(fā)生對(duì)于多肽鑒定、組學(xué)水平蛋白定量會(huì)造成一定的影響與誤差。而使用RapiGest SF無副反應(yīng)的問題，正常使用濃度下(0.1%)對(duì)胰蛋白酶活

性也無影響（表1）。

圖1. Tris水相緩沖體系下各種變性劑的輔助酶切效果比較。樣品為mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。

檢測基于胰蛋白酶誘導(dǎo)N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）水解。將0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氫銨溶液中（pH 7.9，0.2 mM BAEE）。檢測△BAEE在253 nm下的吸收值（5分鐘內(nèi)的斜率）。

 

RapiGest SF雖然是一種表面活性劑，但其全面適應(yīng)液質(zhì)分析的要求。在使用RapiGest SF作為變性劑完成蛋白酶切后，如果只進(jìn)行色譜分析，則可無需對(duì)RapiGest SF進(jìn)行處理。如進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，則通過簡單的加酸步驟就可將RapiGest SF去除。而酸性溶液環(huán)境又恰恰是液質(zhì)分析所需的樣品溶液環(huán)境。事實(shí)上，RapiGest SF是酸性不穩(wěn)定表面活性劑，在酸性條件下（pH2）極易水解。RapiGestSF的結(jié)構(gòu)及其水解產(chǎn)物見圖2。酸化后RapiGest SF降解為兩個(gè)產(chǎn)物：2-十二酮和3-羥（2,3-二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，通過離心去除。后者在水溶液中溶解度很高，在反相LC模式下不保留。因此，酶消解后的水溶液可直接進(jìn)行LC-MS或MALDI-MS分析。

圖 2. RapiGest SF在酸性溶液中的降解產(chǎn)物。

 

圖3為Ra piGest SF輔助的人單抗酶解的實(shí)例。通過BiopharmaLynxTM軟件分析，其序列覆蓋度為98%。而且LC/MS分析中沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未發(fā)現(xiàn)的原因是由于此部分序列為2個(gè)氨基酸的超短肽或單個(gè)氨基酸（R或K），其無法在反相柱上保留。

圖 3.LC-MS分析RapiGest SF輔助下的人單抗胰蛋白酶酶解多肽。

 

由于其表面活性劑的屬性，RapiGest SF可以非�？焖俚貙�(duì)蛋白完成變性，從而縮短酶解實(shí)驗(yàn)時(shí)間。圖4顯示，RapiGest SF輔助下，完全酶解馬肌紅蛋白只需要5分鐘。而由于肌紅蛋白屬球蛋白，其在不充分變性的情況下將難以酶解。在對(duì)照反應(yīng)中，單純與胰蛋白酶孵育條件下，即使到9小時(shí)后，仍只有少量的蛋白被酶解；而使用了RapiGest SF試劑的體系，酶解效率顯著提升。

 

圖 4.有無RapiGest SF輔助下，馬肌紅酶解效果對(duì)比。

 

RapiGest SF自2002年推出以來，已經(jīng)過10年的使用，它良好的性能被廣泛認(rèn)可，對(duì)各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用^[5]。RapiGest SF已經(jīng)成為大部分生物質(zhì)譜科學(xué)家的常規(guī)必備試劑。

 

(1) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly,mass spectrometry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003, 75, 6023-6028.

(2) Huang HZ, Nic hols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009, 81, 1686-1692.

(3) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 711-715.

(4) Chen EI, Cociorva D, Norris JL, Yates JR 3rd. Optimization of Mass Spectrometry-Compatible Surfactants for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 2007, 6, 2529-2538.

(5) Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometryc haracterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2331-2336.