對(duì)于微量而且復(fù)雜的樣品，如蛋白質(zhì)組學(xué)樣品、蛋白藥物中的殘留宿主細(xì)胞蛋白（HCP）等，不但需要高靈敏的納升級(jí)液相，而且需要更為充分的分離。在線二維納升分離技術(shù)（on-line 2D NanoLC）應(yīng)運(yùn)而生，并已成為微量復(fù)雜樣品液質(zhì)分析所必不可少的分離手段。

 

傳統(tǒng)的納升在線二維技術(shù)，一般采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）作為第一維，反相色譜（RP）作為第二維的分離手段。這種方法是根據(jù)樣品在鹽溶液中的離子特性與疏水性，這兩種屬性間的正交關(guān)系實(shí)現(xiàn)的。但是SCX-RP技術(shù)在納升級(jí)分離中卻困難重重。困難主要來自SCX分離維度。在SCX分離中需要使用濃度較高的鹽溶液作為流動(dòng)相，但含鹽流動(dòng)相易發(fā)生鹽析或?qū)е聵悠吩诠苈穬?nèi)沉淀，而納升液相的管路內(nèi)徑又非常�。�25-100微米）。因此，在實(shí)際運(yùn)用SCX-RP分離時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)管路阻塞而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

 

為此，除提供傳統(tǒng)的SCX-RP分離技術(shù)外，沃特世創(chuàng)造性地開發(fā)了雙反相二維分離方法。（RP-RP）。這種RP-RP技術(shù)不必使用高濃度鹽溶液作為流動(dòng)相，避免了離子交換分離易造成的管路阻塞問題，從而大大提高了納升二維液相的系統(tǒng)穩(wěn)定性和實(shí)用性。更令人興奮的是，經(jīng)過哈佛醫(yī)學(xué)院的Jarrod A. Marto全面的實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，較SCX-RP方法， 運(yùn)用RP-RP分離技術(shù)得到的液質(zhì)分析結(jié)果更好（圖1）[1] RP-RP雙反相二維方法可以幫助科學(xué)家得到更多的蛋白質(zhì)分析結(jié)果.

 

這是因?yàn)椋?、SCX方法使用的鹽緩沖液易產(chǎn)生離子噪音背景，從而影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量；2、SCX分離效果取決于多肽所攜帶的電荷數(shù)，而多肽攜帶電荷數(shù)量類別有限，因此第一維SCX分離度較差，造成液質(zhì)數(shù)據(jù)信息質(zhì)量不高。

R P-R P雙反相分離技術(shù)在第一、第二維都使用了反相色譜，那么它是如何實(shí)現(xiàn)二維分離所必須的分離性質(zhì)的正交呢？原來，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在不同pH值環(huán)境下，多肽的反相保留行為是不一樣的（圖2）[2]。根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，沃特世的科學(xué)家開發(fā)出了獨(dú)有的RP-RP納升在線二維系統(tǒng)——nanoACQUITY UPLC^®  System with 2D-LC。這個(gè)系統(tǒng)的分離柱，使用了UPLC一貫的亞二微米顆粒填料，因此具有了UPLC的超高分離度等優(yōu)點(diǎn)。此外，它還不需要分流就可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的納升流速，可為實(shí)驗(yàn)室節(jié)省巨大的高純度流動(dòng)相購(gòu)買費(fèi)用及廢液處理費(fèi)用，而且更加環(huán)保。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相二維系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下：

■ 較SCX-RP技術(shù)，使用RP-RP系統(tǒng)可得到更多的蛋白鑒定結(jié)果。

■ RP-RP系統(tǒng)較SCX-RP系統(tǒng)更穩(wěn)定、耐用。

■ 與nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分離效果。

■ 不分流實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的納

nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相在線二維系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及分析流程如圖3，其中包括三根色譜柱：高pH反相柱、捕獲柱、低pH反相柱。在此系統(tǒng)中，第一維色譜柱為高pH色譜柱。樣品進(jìn)入第一維色譜柱后，第一維梯度泵可按使用者要求，自動(dòng)地階梯式提高有機(jī)相比例，以將樣品中不同疏水性肽段分批洗脫下來。從高pH反相柱上洗脫下的多肽會(huì)被富集柱捕獲。每批次被富集的多肽，將在第二維泵的線性梯度模式下進(jìn)入低pH反相分析柱，在這里經(jīng)過充分分離后，樣品將到達(dá)離子源，進(jìn)入質(zhì)譜分析器。

 

其中左下圖為結(jié)構(gòu)示意圖。步驟①：樣品被自動(dòng)進(jìn)樣器采集后，在第一維梯度泵的推動(dòng)下進(jìn)入高pH色譜柱。步驟②：樣品在第一維泵階梯式梯度作用下，將一部分多肽沖出，后被捕獲柱富集。其中第二維梯度泵通過施加9倍于第一維泵的水相流動(dòng)相，將溶劑稀釋為適合捕獲柱富集的體系。步驟③：在六通閥切換后，第二維泵通過線性梯度，將多肽樣品進(jìn)行充分分離并送至質(zhì)譜分析。在執(zhí)行完步驟①后，步驟②與步驟③交替進(jìn)行直到完成所需分析。雙反相在線二維系統(tǒng)nanoACQUIT Y UP LC System with2D-LC已經(jīng)在多肽的液質(zhì)分析方面被廣泛應(yīng)用，幫助研究人員取得了眾多極具價(jià)值的研究成果。

圖3. nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及分析流程圖。

 

(1) Zhou F, Cardoza JD, Ficarro SB, Adelmant GO, Lazaro JB, Marto JA. Online Nanoflow RP-RP-MS Reveals Dynamics of Multicomponent Ku Complex in Response to DNA Damage. J Proteome

Res. 2010, 9, 6242-6255.

(2) Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC. Two-dimensionalseparation of peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second separation dimensions. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703.