Jo-Ann M. Jablonski、Thomas E. Wheat and Diane M. Diehl；

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

用于進行分離和純化的色譜分離方法與分析型分離方法受到相同物理和化學原理的制約。然而，在制備型試驗中，科學家通常在大型柱上和高質量負載下分離化合物，并需要更高的分離度以提高所收集組分的純度和回收率。雖然設計更緩的梯度是提高分離度的一種較好的首選方法，但改變整個分離過程的梯度斜率可導致峰寬加大和總運行時間增加�？商娲�普通更緩梯度的聚焦梯度僅對需要增加分離度的色譜圖部分減小梯度斜率，從而可在不增加總運行時間的情況下提高對洗脫時間接近的色譜峰的分離度。聚焦梯度可根據搜索運行或者直接從第一次制備運行進行定義。

 

梯度開發(fā)步驟

■ 確定制備規(guī)模的系統(tǒng)體積

■ 運行搜索梯度

■ 設計聚焦梯度

■ 在制備柱上運行聚焦梯度

 

儀器

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 2525型二元梯度模塊、2767型樣品管理系統(tǒng)、系統(tǒng)流路組織器、2996型光電二極管陣列檢測器、

AutoPurification™流通池

色譜柱： XBridge™制備型OBD™ C18柱19 x 50 mm、5μm（貨號186002977）

流速： 25mL/分鐘

流動相A： 0.1%的甲酸水溶液

流動相B： 0.1%甲酸-乙腈溶液

波長： 260 nm

 

磺胺: 10 mg/mL

磺胺噻唑: 10 mg/mL

磺胺二甲嘧啶: 20 mg/mL*

磺胺甲二唑: 10 mg/mL

磺胺甲唑: 10 mg/mL

磺胺二甲異唑: 4 mg/mL

總濃度: 64 mg/mL（溶于二甲基亞砜）

*選定用于聚焦梯度的色譜峰

 

確定制備規(guī)模的系統(tǒng)體積

■ 取下色譜柱并更換成兩通。

■ 流動相A使用乙腈，流動相B使用包含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈（解決了非加成性混合和粘滯問題）。

■ 在254 nm下進行監(jiān)測。

■ 采集100% A的基線數(shù)據5分鐘。

■ 在5.01分鐘時，將梯度設置為100% B并再采集5分鐘數(shù)據。

■ 測定100% A和100% B之間的吸光度差異。

■ 計算存在50%吸光度差異時的時間。

■ 計算步驟開始時（5.01分鐘）和50%時間點之間的時間差異。

■ 將時間差異乘以流速。

 

系統(tǒng)體積被定義為從梯度形成點到色譜柱前端的體積。系統(tǒng)體積用于聚焦梯度的設計。如圖1所示，本試驗所用儀器配置下的系統(tǒng)體積是3.0 mL。

 

在2.47分鐘洗脫3號色譜峰的溶劑濃度在較早的時間點上形成。如圖3所示，檢測器和梯度形成點之間的偏移量等于系統(tǒng)體積加上柱體積。用于這臺特定系統(tǒng)的偏移量等于早期確定的3 mL系統(tǒng)體積再加上19 x 50 mm制備柱的體積（11.9 mL），即14.9 mL。在25 mL/分鐘的流速下，溶劑濃度到達檢測器需要0.59分鐘。2.47分鐘的洗脫時間減去0.59分鐘的偏移時間等于1.88分鐘。由于初始大規(guī)模梯度有0.39分鐘的保留時間，因此形成洗脫色譜峰的乙腈百分比的時間是1.88分鐘減去0.39分鐘，即1.49分鐘。

 

計算在2.47分鐘洗脫色譜峰的乙腈百分比。原始大規(guī)模梯度在5分鐘內洗脫 5-50% B，最初梯度的駐留時間為0.39分鐘。

 

根據在2.47分鐘洗脫出色譜峰的梯度計算得到的乙腈百分比是13.4%，但由于梯度開始于5%乙腈，因此洗脫該峰的乙腈實際濃度是13.4% + 5%，或者說18.4%乙腈。

 

旨在分離梯度中部洗脫時間接近的色譜峰的聚焦梯度應開始于原始小規(guī)模試驗條件，通常為0-5% B。進樣開始后立即將梯度快速增加至比能洗脫目標峰的預期乙腈百分比濃度低5%的乙腈百分比。在搜索梯度中所用的1/5斜率下繼續(xù)進行緩的聚焦梯度部分。預計一個五倍的更緩梯度可為洗脫時間接近的色譜峰提供更高的分離度。終止高出可洗脫目標峰的預期乙腈百分比濃度5%的聚焦梯度部分。原始梯度在5分鐘內洗脫5-50% B，或者說在5分鐘內梯度變化45%。這樣，乙腈濃度每分鐘變化9%（從9%-10%左右簡化得到）。然后，新的梯度斜率應為10%的1/5，或者說每分鐘變化2%。10%的乙腈濃度改變通過每分鐘變化2%而達到，說明用于分離3號和4號峰的聚焦梯度時間片段應持續(xù)5分鐘。一旦梯度的聚焦部分完成，乙腈百分比快速增加至95% B，以清洗色譜柱。平衡色譜柱后，終止初始條件下的梯度。5-45% B = 每分鐘9%（舍入至每分鐘10%）梯度斜率每分鐘變化2%。

聚焦梯度可明顯提高圖4所示色譜圖中3號峰和4號峰的分離度。5號峰和6號峰因受到梯度聚焦部分的影響而出現(xiàn)移位，梯度部分繼續(xù)在較緩的斜率下洗脫化合物，直至設定用于進行柱清洗的較高百分比的乙腈進入色譜柱。較緩的聚焦梯度能在不增加運行時間的情況下對天然混合組分提供更高的分離度，因而使色譜分析師能夠獲得更純的產物和更好的回收率。

 

當科學家為后續(xù)試驗進行產物純化時，需要在高質量負載下分離化合物。聚焦梯度可在不增加運行時間的情況下提高對洗脫時間接近色譜峰的分離度，從而改善分離效果。系統(tǒng)體積信息可以對制備型梯度進行直接優(yōu)化。使用聚焦梯度可提高產物產率和純度，同時不會增加溶劑消耗量和廢液生成量。聚焦梯度方法可實現(xiàn)分離，因而有助于控制純化成本。

 

50多年來，沃特世公司(NYSE:WAT)通過提供實用和可持續(xù)的創(chuàng)新，使醫(yī)療服務、環(huán)境管理、食品安全和全球水質監(jiān)測領域有了顯著進步，從而為實驗室相關機構創(chuàng)造了業(yè)務優(yōu)勢。

 

作為一系列分離科學、實驗室信息管理、質譜分析和熱分析技術的開創(chuàng)者，沃特世技術的重大突破和實驗室解決方案為客戶的成功創(chuàng)造了持久的平臺。2010年沃特世擁有16.4億美元的收入和5,400名員工，它將繼續(xù)帶領全世界的客戶探索科學并取得卓越成就。