用于植物油快速質(zhì)控的自動計(jì)算法以及品質(zhì)鑒定
沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德市
植物油是食品、化妝品和個人護(hù)理品的重要成分，主要來自于世界各地的22種油料作物。生產(chǎn)加工、貯存、運(yùn)輸和銷售各環(huán)節(jié)都對植物油的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。偶發(fā)事件和故意事件均會導(dǎo)致植物油的交叉污染。現(xiàn)已頒布了包括315/93/EEC、2568/91/EEC、EC 333/2007和EC 640/2008在內(nèi)的多部法規(guī)，要求鑒定植物油的品質(zhì)，并避免污染，從而保障公共健康和公平交易。
為了確保產(chǎn)品質(zhì)量，滿足法規(guī)要求并維護(hù)公司最有價(jià)值的資產(chǎn)——品牌形象，植物油公司對植物油的生產(chǎn)過程，從原料到成品全過程進(jìn)行監(jiān)控。目前，植物油分析主要依靠氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。氣相色譜法要求在分析前進(jìn)行衍生化，這既耗時(shí)又費(fèi)力2。為了實(shí)現(xiàn)完全分離，普通的高效液相色譜法要求使用鹵代溶劑或使用會使運(yùn)行時(shí)間更長的非鹵代溶劑3-6，。自鹵代溶劑被認(rèn)識到具有致癌作用后，鹵代溶劑的使用在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室受到了限制。因此，人們對用于植物油質(zhì)量控制和品質(zhì)鑒定更有效的分析工具的需求日漸增加。
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)是新一代液相色譜平臺。使用UPLC®/PDA/ELSD/質(zhì)譜檢測器，可以更快進(jìn)行篩選、在不使用鹵代溶劑7-10條件下對植物油的表征建立高分離度的方法。只需一次進(jìn)樣，超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)就能得到多種類型的數(shù)據(jù)，產(chǎn)生重現(xiàn)好的指紋圖譜數(shù)據(jù)，鑒別甘油三酸酯的組分，并評估植物油氧化和分解程度。與普通的高效液相色譜相比，超高效液相色譜縮短了分析時(shí)間，減少了溶劑用量，并能從一次進(jìn)樣中提供更高分離度并帶有更多信息的色譜圖。因此，超高效液相色譜法的性價(jià)比更高。本技術(shù)文獻(xiàn)描述了用于植物油質(zhì)控和品質(zhì)鑒定的更為高效的系統(tǒng)解決方案，即使用UPLC和EmpowerTM 2軟件的用戶自定義字段的計(jì)算功能，自動定量并報(bào)告植物油樣品是否符合用戶設(shè)定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。此方案不再需要人工計(jì)算，從而避免了可能的人為誤差并能夠快速而準(zhǔn)確地報(bào)告關(guān)鍵信息。掌握了準(zhǔn)確、及時(shí)的結(jié)果，決策者就能提高交貨效率和產(chǎn)量，即減少不合格產(chǎn)品，避免產(chǎn)品召回，并最大限度地減少責(zé)任訴訟。本文的實(shí)驗(yàn)部分提供了關(guān)于自定義字段計(jì)算的例子，并附有其詳細(xì)步驟。
實(shí)驗(yàn)
樣品準(zhǔn)備：
食用油，購買自當(dāng)?shù)氐氖称冯s貨店。用2-丙醇將食用油樣品
稀釋為6 mg/ml的溶液，以備分析之用。
超高效液相色譜條件：
超高效液相色譜系統(tǒng)： ACQUITY UPLC，PDA檢測器
軟件： Empower 2
PDA參數(shù)：
檢測波長： 195-300nm
采樣率： 20 pts/s
過濾響應(yīng)速度： 快
超高效液相色譜參數(shù)：
色譜柱： ACQUITY BEH C18 2.1 x 150 mm
弱洗脫： 2-丙醇(每次洗脫用量：500 μL)
強(qiáng)洗脫： 2-丙醇(每次洗脫用量：500 μL)
充填洗脫： 10%的CH3CN水溶液(每5分鐘)
流動相A： CH3CN
流動相B： 2-丙醇
柱溫： 30°C
進(jìn)樣量： 2 μL(滿環(huán)定量)
梯度條件：
時(shí)間 (min) 流速 (mL/min) %B 曲線
0 0.15 10 —
22 0.15 90 6
平衡色譜柱和UPLC系統(tǒng)條件：
時(shí)間 (min) 流速 (mL/min) %B 曲線
0 0.13 100 —
18 0.13 10 11
21.5 0.7 10 11
24.5 0.15 10 11
25 0.15 10 11
說明：運(yùn)行樣品組之前，先進(jìn)一針空白試樣2-丙醇；該檢測值被用作PDA 3D譜圖的空白扣除。
1. 指示峰3O(峰面積OOL/標(biāo)記峰面積)>0.84或<0.86，則合格；否則不合格。
3. 指示峰LLO(峰面積LLO/標(biāo)記峰面積)>0.39或<0.41，則合格；否則不合格。
4. 指示峰LLL(峰面積LLL/標(biāo)記峰面積)>0.039或<0.045，則合格；否則不合格。
5. 指示雜質(zhì)峰(雜質(zhì)峰面積/標(biāo)記峰面積)<0.42，則合格；否則不合格。
創(chuàng)建計(jì)算峰面積比自定義字段的步驟11 ：
1. 點(diǎn)擊“配置系統(tǒng)”，進(jìn)入配置管理員；在樹形結(jié)構(gòu)中點(diǎn)擊“項(xiàng)目”。
2. 選擇并右擊所需的項(xiàng)目。
3. 選擇“屬性”，打開“項(xiàng)目屬性”窗口。
4. 點(diǎn)擊“自定義字段”標(biāo)簽；然后點(diǎn)擊“新建”，打開“數(shù)據(jù)和類型選擇”窗口(圖1)。
5. 在字段類型中選取“峰”，在數(shù)據(jù)類型中選取“實(shí)數(shù)(0.0)”；然后點(diǎn)擊“下一步”打開“選擇來源”窗口，如圖2所示。
6. 在“數(shù)據(jù)來源”中選擇“計(jì)算”，在“樣品類型”和“峰類型”中選擇“全部”；在“搜索順序”中選擇“只限于結(jié)果組”，然后在彈出窗口中點(diǎn)擊確定”；不要勾選“全部或沒有”以及“丟失峰”選項(xiàng)；點(diǎn)擊“下一步”，打開“輸入公式”窗口，如圖3所示。
7. 將面積/IS[面積]輸入至字段中；點(diǎn)擊“下一步”，打開“數(shù)值型參數(shù)”窗口(使用默認(rèn)值)。
8. 點(diǎn)擊“下一步”，打開“輸入名稱”窗口。
9. 輸入新的字段名(例如，此處所用的字段名是“Ratio _IS”)；在“創(chuàng)建該字段”中選擇“項(xiàng)目”。
10. 點(diǎn)擊“完成”，這樣就創(chuàng)建了一個名為“Ratio_IS”的自定義字段，用于計(jì)算峰面積比，如圖4所示。
1. 點(diǎn)擊“配置系統(tǒng)”，打開配置管理員；在樹形結(jié)構(gòu)中點(diǎn)擊“項(xiàng)目”。
2. 選擇并右擊所選擇的工作項(xiàng)目。
3. 選擇“屬性”，打開“項(xiàng)目屬性”窗口。
4. 點(diǎn)擊“自定義字段”標(biāo)簽；然后點(diǎn)擊“新建”，打開“數(shù)據(jù)和類型選擇”窗口，如圖1所示。
5. 在字段類型中選擇“峰”，在數(shù)據(jù)類型中選取“布爾(0.0)”；然后點(diǎn)擊“下一步”，打開“選擇來源”窗口。
6. 在“數(shù)據(jù)來源”中選擇“計(jì)算”，在“樣品類型”和“峰類型”中選擇“全部”；在“搜索順序”中選擇“只限于結(jié)果組”，然后在彈出窗口中點(diǎn)擊“確定”；選擇“全部或沒有”選項(xiàng)，在彈出窗口中點(diǎn)擊“是”；然后點(diǎn)擊“下一步”，打開“輸入公式”窗口。
7. 將以下公式輸入至字段中：
GTE(3O[Ratio_IS],0.841)<E(3O[Ratio_IS],0.859])*EQ(Name,“3O”)+NEQ(Name,”3O”)*-1*50000
8. 點(diǎn)擊“下一步”，打開“翻譯定義”窗口，如圖5所示。
9. 在“0”旁邊，輸入“不合格”；在“1”旁邊，輸入“合格”；然后點(diǎn)擊“下一步”，打開“輸入名稱”窗口。
10. 輸入一個名稱(例如，此處使用的是“Oly_OOO”)；在“創(chuàng)建該字段”中選擇“項(xiàng)目”。
11. 點(diǎn)擊“完成”，這就創(chuàng)建了一個名為“Oly_OOO”的自定義字段用于檢驗(yàn)峰面積比(OOO峰面積除以標(biāo)記峰面積)是否符合指示峰OOO的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，如圖6所示。重復(fù)進(jìn)行第1-8步，以確定其余的指示峰是否合格：對于指示峰OOL，在第4步中，在“輸入公式”窗口中輸入以下公式：
GTE(OOL[Ratio_IS],1.18)<E(OOL[Ratio_IS],1.21])*EQ(Name,“OOL”)+NEQ(Name,“OOL”)*-1*50000. 在第7步中，在字段名中輸入“Oly_OOL”，創(chuàng)建字段“Oly_OOL”，以檢驗(yàn)峰面積比(OOL峰面積除以標(biāo)記峰面積)是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。對于指示峰LLO，在第4步中，在“輸入公式”窗口中輸入以下公式：
GTE(LLO[Ratio_IS],0.39)<E(LLO[Ratio_IS],0.41])*EQ(Name,“LLO”)+NEQ(Name,“LLO”)*-1*50000. 在第7步中，在字段名中輸入“Oly_LLO”，創(chuàng)建字段“Oly_LLO”， 以檢驗(yàn)峰面積比(LLO峰面積除以標(biāo)記峰面積)是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。對于指示峰LLL，在第4步中，在“輸入公式”窗口中輸入以下公式：
GTE(LLL[Ratio_IS],0.039)<E(LLL[Ratio_IS],0.045])*EQ(Name,“LLL”)+NEQ(Name,“LLL”)*-1*50000. 在第7步中，在字段名中輸入“Oly_ LLL”，創(chuàng)建字段“Oly_ LLL”， 以檢驗(yàn)峰面積比(LLL峰面積除以標(biāo)記峰面積)是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
對于雜質(zhì)指示峰，在第4步中，在“輸入公式”窗口中輸入
以下公式：
GT(Impurity[Ratio_IS],0.42)*EQ(Name,”Impurity”)+NEQ(Name,“Impurity”)*-1*50000. 在第7步中，在字段名中輸入“Oly_Impurity”，創(chuàng)建字段“Oly_ Impurity”，以檢驗(yàn)峰面積比(雜質(zhì)峰面積除以標(biāo)記峰面積)是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
本方法用定時(shí)組功能計(jì)算雜質(zhì)峰的總和：
1. 在“編輯處理方法”窗口中，選擇“定時(shí)組”標(biāo)簽，如圖7所示。
2. 在“名稱”字段中輸入雜質(zhì)名稱，在“開始時(shí)間”字段中輸入“3”，在“結(jié)束時(shí)間”字段中輸入“13.6”。
3. 勾選“不包括已知峰”字段。在處理方法中標(biāo)記選定的標(biāo)記峰和指示峰：
1. 在“編輯處理方法”窗口中選擇“組分”標(biāo)簽。
2. 將保留時(shí)間為9.81 min的峰名稱改為IS，在“峰標(biāo)簽”字段中輸入“標(biāo)記峰”，如圖8所示。
3. 將保留時(shí)間為13.79 min的峰名稱改為3L，在“峰標(biāo)簽”字段中輸入“LLL”。
4. 將保留時(shí)間為14.85 min的峰名稱改為2LO，在“峰標(biāo)簽”字段中輸入“LLO”。
5. 將保留時(shí)間為15.87 min的峰名稱改為2OL，在“峰標(biāo)簽”字段中輸入“OOL ”。
6. 將保留時(shí)間為16.85 min的峰名稱改為OOO，在“峰標(biāo)簽”字段中輸入“OOO”。
在處理方法中創(chuàng)建命名組的步驟：
1. 在“編輯處理方法”窗口中選擇“命名組”標(biāo)簽。
2. 在“名稱”欄中輸入3O、LLL、LLO、OOL和Oly，如圖9所示。
3. 分別將OOO、3L、2LO、2OL和IS從“單峰組分”拖至各自相應(yīng)的命名組中，如圖9所示。創(chuàng)建合格或不合格報(bào)告模板的步驟：
1. 點(diǎn)擊“方法”標(biāo)簽，選擇一份報(bào)告，右擊該報(bào)告；選擇“打開”，以顯示“編輯報(bào)告方法”窗口。
2. 在“編輯報(bào)告方法”窗口中選擇“新建”，打開“新方法／組”窗口。
3. 選擇“創(chuàng)建新報(bào)告方法”，勾選“使用報(bào)告方法／組向?qū)А边x項(xiàng)；然后點(diǎn)擊“確定”，打開“報(bào)告方法模板向?qū)А薄?BR>4. 選擇“單個報(bào)告”，然后點(diǎn)擊“下一步”，打開“新方法向?qū)А贝翱凇?BR>5. 在報(bào)告類型中選擇“單個”，然后點(diǎn)擊“完成”，顯示一個報(bào)告方法模板。
6. 在色譜圖上右擊，選擇“屬性”，打開“色譜圖屬性”窗口(圖10)。
7. 選擇“峰標(biāo)簽”，勾選“僅使用峰標(biāo)簽”，然后點(diǎn)擊“確定”。
8. 右鍵單擊“表”，選擇“屬性”，打開“表屬性”窗口。
9. 選擇“峰”標(biāo)簽，勾選“峰組”。
10. 點(diǎn)擊“表”標(biāo)簽，然后在樹形結(jié)構(gòu)中點(diǎn)擊所需的峰。雙擊每個指示峰，以將相應(yīng)的自定義字段添加到結(jié)果表格中，如圖11所示。
11. 點(diǎn)擊“確定”，輸入該報(bào)告模板的名稱(例如，此處顯示的名稱是“特級天然橄欖油質(zhì)控報(bào)告”)，然后在工具欄中點(diǎn)擊“保存”。
結(jié)果和討論
不使用鹵代溶劑做流動相的普通高效液相色譜法很難分離植物油的主要組分——甘油三酸酯。圖12為普通高效液相色譜法(2根5μm粒徑顆粒填充的150mm長的C18柱，蒸發(fā)光散射檢測器ELSD)得到的大豆油的典型色譜圖，使用乙腈和二氯甲烷作為流動相，實(shí)現(xiàn)該分離需要60多分鐘。由于二氯甲烷在240nm以內(nèi)具有紫外吸收，這會干擾甘油三酸酯的紫外吸收(最大波長吸收值約210nm)，因此使用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)進(jìn)行檢測。
ACQUITY UPLC系統(tǒng)的設(shè)計(jì)特點(diǎn)是使用小顆粒裝填技術(shù)的高效色譜柱，以進(jìn)行更快速、更靈敏和更高分離度的分離。UPLC的溶劑傳送系統(tǒng)能承受高達(dá)15,000 psi的背壓，因此能夠使用2-丙醇等高黏度溶劑進(jìn)行植物油分析。由于2-丙醇對植物油的溶解性好12、低毒，透射度限制低，便于對甘油三酸酯進(jìn)行紫外檢測，因此2-丙醇被選作強(qiáng)洗脫液。圖13為關(guān)于同一大豆油樣品的10張疊加的紫外色譜圖說明UPLC法的重現(xiàn)性，此分離使用1.7μm粒徑的2.1 x 150mm的 BEH C18色譜柱，乙腈/2-丙醇作為流動相，整個運(yùn)行時(shí)間縮短為22分鐘。圖12和圖13比較，具有相似的甘油三酸酯峰型，但UPLC法具有更高的分離度，更短的運(yùn)行時(shí)間。數(shù)據(jù)表明不使用致癌溶劑作為流動相，使用 UPLC分離植物油中的組分具有明顯優(yōu)勢。用于植物油分析的乙腈/2-丙醇流動相的UPLC系統(tǒng)可使用PDA、ELSD和MS檢測器，不像其他用于普通高效液相色譜法的溶劑。一次進(jìn)樣便可得到多種數(shù)據(jù)類型，并可以產(chǎn)生可重現(xiàn)的指紋圖譜數(shù)據(jù)7，通過質(zhì)譜法鑒別甘油三酸酯組分10，并用PDA多波長掃描測定植物油的氧化程度8。目前已知植物油具有特征的甘油三酸酯比，這對植物油指紋圖譜5-8的鑒別很有用。如圖14-16所示，核桃油、葡萄籽油、芝麻油、特級天然橄欖油A、特級天然橄欖油B、榛子油、茶籽油、玉米油、加拿大低酸油、高油酸葵花籽油和普通葵花籽油的紫外色譜圖證實(shí)，每種油樣品都具有獨(dú)特的色譜類型，即相對峰強(qiáng)度。
為了高效使用峰強(qiáng)度比進(jìn)行品牌質(zhì)控和質(zhì)量鑒定，Empower 2軟件的自定義字段計(jì)算功能可根據(jù)用戶設(shè)定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)自動將原始色譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為合格或不合格報(bào)告。以特級天然橄欖油A為例說明該改進(jìn)的方法。圖17為特級天然橄欖油A的疊加紫外色譜圖和峰面積。甘油三酸酯的峰面積從最強(qiáng)峰(OOL)到最弱峰(LLL)其RSD值(n=6)<0.9%。共有20多個可見峰，任一峰都能被用作標(biāo)記峰或指示峰，用以計(jì)算峰面積比。為了便于討論，將之前確定的甘油三酸酯的峰OOO、OOL、LLO和LLL選作指示峰10，將僅出現(xiàn)在橄欖油產(chǎn)品中、通過紫外檢測觀察到的保留時(shí)間為9.8分鐘的強(qiáng)峰選作標(biāo)記峰13。由于大多數(shù)廉價(jià)的蔬菜油和降解油具有很多保留時(shí)間低于13.6分鐘的其它強(qiáng)峰9，因此可用定時(shí)組功能(圖7)創(chuàng)建雜質(zhì)指示峰，以監(jiān)測是否存在污染。該雜質(zhì)指示峰是指標(biāo)記峰之外的保留時(shí)間介于3-13.6分鐘的所有峰的總和。通過創(chuàng)建自定建自定義字段“Ratio_IS”(圖4)，可用Empower 2軟件自動計(jì)算峰面積比(指示峰面積除以標(biāo)記峰面積)。表1總結(jié)了峰面積比的結(jié)果以及STDEV值�！胺迕娣e比±3xST-DEV”被用作每個指示峰的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。由于地理和其它種植條件的差異，植物油的某一特定類型會存在差異。該數(shù)值在比較其它植物油樣品是否符合基于特定油品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)方面具有極大的價(jià)值。
現(xiàn)在，Empower 2軟件能夠使用自定義字段計(jì)算、命名組、定時(shí)組和報(bào)告模板(如圖6、7、9、10和11所示)，根據(jù)特級天然橄欖油A的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，自動計(jì)算并報(bào)告樣品合格與否的結(jié)果。圖18為特級天然橄欖油A的典型Empower質(zhì)控報(bào)告。該報(bào)告表明所有指示峰均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。Empower軟件的這些高級功能避免了人工計(jì)算步驟，因此能避免可能出現(xiàn)的人為誤差。
昂貴的特級天然橄欖油通常會被摻入廉價(jià)橄欖油和其它植物油(例如大豆油和榛子油)。圖19為一份特級天然橄欖油B的報(bào)告。所有指示峰均表明該特級天然橄欖油B未通過根據(jù)特級天然橄欖油A制定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。在該色譜圖中存在保留時(shí)間<13.6 min的額外峰，這些數(shù)據(jù)清楚地表明兩種品牌的橄欖油樣品存在差異，并證實(shí)并非所有市售的特級天然橄欖油的品質(zhì)都相同。圖20為一份摻入9%榛子油的特級天然橄欖油A的報(bào)告。所有指示峰均表明該摻假樣品不符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。而且，根據(jù)特級天然橄欖油A制定的同一質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)用于分析其它植物油(圖14-16)，同樣摻入1%大豆油或1%玉米油的特級天然橄欖油A，均不合格。
之前描述的是使用UPLC-TOF和集成軟件工具檢測橄欖油摻假的化學(xué)計(jì)量方法14。本技術(shù)文獻(xiàn)為植物油質(zhì)控和品質(zhì)鑒定提供了可供選擇的另一種解決方案。本方法可完全自動地獲取并處理數(shù)據(jù)，從而生成明確的合格或不合格報(bào)告。
結(jié)論
具有Empower 2 軟件的ACQUITY UPLC系統(tǒng)能不需要衍生化和鹵化溶劑，且能快速分析植物油樣品并進(jìn)行品質(zhì)鑒定。
UPLC系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)具有良好的重現(xiàn)性、精確性和準(zhǔn)確性，而且簡單易懂。分離速度比普通高效液相色譜法快三倍，所消耗的溶劑量減少8倍，所產(chǎn)生的有害廢物也減少8倍；從而能夠節(jié)省成本，提高安全性。ACQUITY PDA檢測器能產(chǎn)生高分離度和高重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)，這有助于輕松建立用于制定每種品牌植物油的質(zhì)控和品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)的指紋圖譜數(shù)據(jù)。借助Empower 2軟件的自定義字段計(jì)算功能，關(guān)鍵的產(chǎn)品質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)可從原始數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確得出并根據(jù)用戶設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)快速傳送，有效地出具簡單易懂的合格或不合格報(bào)告。決策者能根據(jù)這些重要信息及時(shí)做出決定，從而提高生產(chǎn)率。使用本UPLC方法，植物油公司能夠輕松自信地鑒定產(chǎn)品的品質(zhì)和質(zhì)量。與植物油產(chǎn)品純度方面利益相關(guān)的其他行業(yè)，例如化妝品公司、個人護(hù)理品公司和食品公司，也將從本方法中受益。
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