生物標(biāo)志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達(dá)分析功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready 應(yīng)用
生物標(biāo)志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達(dá)分析功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready應(yīng)用
Sabine Lohmann*, Andrea Herold*, Tobias Bergauer#, Anton Belousov+, Gisela Betzl *, Manuel Dietrich*, Manuela Poignée-Heger *, David Geho’, Martin Weisser+
*Roche Applied Science, Penzberg, 德國
+Roche Pharma, Penzberg, 德國
#Roche Pharma, Basel, 瑞士
’Roche Pharma, Nutley, 美國
前言
生物標(biāo)志物與早期臨床藥物研發(fā)抗-TWEAK復(fù)合物研發(fā)舉例
TWEAK（腫瘤壞死因子樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)因子）是一種多功能細(xì)胞因子，可控制包括細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡、血管生成，以及炎癥在內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)。TWEAK通過與Fn14結(jié)合發(fā)揮作用，F(xiàn)n14 是一種具有高度誘導(dǎo)性的細(xì)胞表面受體，與包括細(xì)胞核因子- kB（NF-kB）途徑在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑具有相關(guān)性（2）。
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Anti-TWEAK (RO5458640) 是一種直接針對(duì)TWEAK的重組人化 IgG1κ單克隆抗體。RO5458640 可與 TWEAK 結(jié)合，從而阻斷 TWEAK 與受體結(jié)合。Fn14：抑制TWEAK：Fn14 信號(hào)途徑與相應(yīng)下游作用可促進(jìn)腫瘤生長 (3)。
TWEAK 可與細(xì)胞外受體 Fn14 結(jié)合，通過 NF-κB 途徑， TWEAK與 Fn14 的結(jié)合可誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 |
根據(jù)文獻(xiàn)搜索與TWEAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑生物學(xué)芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用“關(guān)鍵詞”搜索功能，于RealTime ready配置門戶網(wǎng)完成一個(gè)RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測(cè)板的配置。為生成首個(gè)假設(shè)，使用RealTime ready NF-kB panel，于9種不同的腫瘤細(xì)胞系（經(jīng)過處理細(xì)胞系對(duì)未處理細(xì)胞系，于不同時(shí)間點(diǎn)，共使用 54 份樣本）中，進(jìn)行體外基因表達(dá)分析。根據(jù)細(xì)胞系結(jié)果，使用簡(jiǎn)化 NF-kB panel（35種參數(shù)），確認(rèn)體內(nèi)小鼠移植模型中的潛在生物標(biāo)志物。基于細(xì)胞系與移植物測(cè)定結(jié)果，鑒定出13種潛在性、候選基因。為對(duì)假設(shè)進(jìn)行檢驗(yàn)，從上述參數(shù)中篩選出 6 種參數(shù)，進(jìn)行人FFPE樣本分析。上述6種參數(shù)與所選參考基因適合于感興趣的實(shí)體腫瘤（BC、CRC、NSCLC、肉瘤、RCC）。已經(jīng)開發(fā)出RealTime ready qPCR檢測(cè)，并已經(jīng)進(jìn)行FFPET RNA分離功能的優(yōu)化。
個(gè)體化醫(yī)療（PHC）根據(jù)基因信息，針對(duì)個(gè)體的遺傳獨(dú)特性，對(duì)個(gè)體進(jìn)行衛(wèi)生保健、疾病預(yù)防與治療服務(wù)，滿足個(gè)體需要。對(duì)特定生物狀態(tài)指示劑的生物標(biāo)志物分子的識(shí)別與鑒定，在個(gè)體化醫(yī)療中具有重要作用（1）。因此，生物標(biāo)志物是藥物從靶點(diǎn)鑒定至藥物應(yīng)用生命周期的核心元素。前列腺素特異性抗原
（PSA）、c-反應(yīng)蛋白（CRP），與HER2/neu僅是眾多生物標(biāo)志物分子中的少數(shù)幾個(gè)。
生物標(biāo)志物研究中，人們對(duì)復(fù)雜生物背景下mRNA表達(dá)研究抱有濃厚興趣。RealTime ready RT-qPCR檢測(cè)與RealTime ready 配置門戶網(wǎng)站在線完成相關(guān)標(biāo)志物基因的選擇，qPCR功能檢測(cè)有助于了解基因表達(dá)概況。LightCycler®480多孔板上RealTime ready 定制型檢測(cè)多孔板上含有用戶選擇的、預(yù)置人、小鼠或大鼠靶序列qPCR檢測(cè)()。我們已經(jīng)建立起細(xì)胞系（體外）、移植小鼠模型（體內(nèi)），與各種人類研究樣本FFPET切片生物標(biāo)志物研究的基因表達(dá)分析工作流。
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生物標(biāo)志物研究RealTime ready qPCR檢測(cè)�？蓾M足不同檢測(cè)質(zhì)量要求。生物標(biāo)志物在治療性藥物復(fù)合物研發(fā)周期全程均非常重要（TWEAK復(fù)合物研發(fā)僅是一個(gè)例子。LightCycler® 480 real-time PCR 平臺(tái)聯(lián)合使用。
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于標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行腫瘤細(xì)胞系（ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1）培養(yǎng)。使用TWEAK或 Anti-TWEAK（RO5458640）分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。于不同時(shí)間點(diǎn)收集腫瘤細(xì)胞系（0、6、24 小時(shí)），將RNA樣本存放（Qiagen）。
細(xì)胞 RNA 分離
使用MagNA Pure LC 儀、MagNA Pure LC RNA Kit –High Perfor-mance（Roche，貨號(hào)：03 542 394 001），與MagNA Pure LC 程序“RNA HP Cells”從細(xì)胞小球中分離總體細(xì)胞 RNA。溶解并混合細(xì)胞裂解物（1 x 106細(xì)胞每 600 µl RLT 緩沖液[Qiagen，貨號(hào)：79216]），并將 2 x 200 µl細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至MagNA Pure Sample Cartridge wells（200 µl每孔）。洗脫裂解液重復(fù)分離制備的 RNA 至 50 µl，并收集洗脫液。FFPE 組織 RNA 分離使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒（Roche，貨號(hào)： 03 270 289 001），根據(jù)操作手冊(cè)（福爾馬林固定、石蠟包埋組織 RNA 分離方案），從10um FFPET 切片中分離總體細(xì)胞 RNA, 經(jīng)過調(diào)整的技術(shù)操作步驟如下：1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30 分鐘；第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分鐘；室溫 High Pure 柱上DNase處理 15 分鐘。經(jīng)過調(diào)整的技術(shù)操作步驟更加快速、上機(jī)時(shí)間更短，顯示其性能具有可比性。
使用NanoDrop儀器進(jìn)行RNA制備物質(zhì)量與定量分析。使用Agilent生物分析儀與RNA Nano芯片進(jìn)行某些樣本RNA完整性分析。
cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master（Roche，貨號(hào)：05 893 151 001）與 1ug 總體RNA進(jìn)行cDNA合成。每份樣本均建立3份獨(dú)立的40µl反應(yīng)液。逆轉(zhuǎn)錄系列RNA稀釋液，并分別進(jìn)行濃縮產(chǎn)物PCR。
實(shí)時(shí)qPCR
進(jìn)行 1g 總 RNA 3 份cDNA合成反應(yīng)混合液、稀釋處理，并將其作為模板，用于RealTime ready Custom Panel Plate, 384（Roche，貨號(hào)：05 582 873 001）。使用LightCycler® 480 Probes Master（Roche，貨號(hào)：04 707 494 001）進(jìn)行含有RNA的反應(yīng)混合物制備。
每孔總體PCR反應(yīng)容積是10 µl，終RNA容量是10ng。羅氏公司為每個(gè)儀器配備有LightCycler® 480 軟件，版本1.5，以及content.txt文件，從而使樣本設(shè)置與結(jié)果分析更加容易。
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工作流描述：NF-κB RealTime ready 定制型多孔檢測(cè)板體外研究
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對(duì)于相關(guān)定量分析來說，通過參考基因表達(dá)進(jìn)行靶基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。理想情況下，標(biāo)準(zhǔn)化處理應(yīng)該能夠補(bǔ)償 RNA/cDNA起始量變異情況，以及cDNA合成或 PCR 擴(kuò)增中潛在抑制劑的作用。參考基因作為內(nèi)源性樣本材料對(duì)照，工作流中，與靶基因一同被處理。為獲取可靠結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化中選擇合適的參考基因非常重要。合適參考基因即：在感興趣的樣本中，性能比較穩(wěn)定的、非表達(dá)調(diào)節(jié)基因（4，5）。如圖 1，于 4 個(gè)參考基因中選擇出 2 個(gè)基因作為參考基因。
 圖 1：9 種細(xì)胞系 4 種參考基因表達(dá)分析。本研究 9 種細(xì)胞系 4 種參考基因絕對(duì)Cq值（重復(fù)檢測(cè)）作圖。使用同樣cDNA混合液進(jìn)行PCR。分析 顯示，兩個(gè)參考基因模式相似，參考基因?yàn)椋篈LAS1 （氨基酮戊酸鹽、Δ-、合成酶 1）與 HPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 1）。第 3 個(gè)基因：MRPL19（線粒體核糖體蛋白 L19）性能非常具有可比性，第 4 個(gè)基因：G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶），具有獨(dú)特模式。因此，我們將 ALAS1 與 HPRT 作為參考基因，進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析。 |
各種實(shí)體腫瘤 9 種細(xì)胞系 NF-kB panel與 RNA 基因表達(dá)分析中，通過Cq值標(biāo)準(zhǔn)化處理，以及聯(lián)合使用 2 個(gè)參考基因（RG），確認(rèn)出 35 個(gè)差異表達(dá)基因。Δ Cq計(jì)算如下：Cq_RG – Cq_靶值，Cq_RG是參考基因：ALAS 與 HPRT Cq均值。9 種細(xì)胞系 TWEAK 受體（Fn14）差異表達(dá)模式見圖 2
應(yīng)用治療復(fù)合物后，藥效學(xué)生物標(biāo)志物（功能性生物標(biāo)志物）會(huì)發(fā)生改變，并顯示治療反應(yīng)（6）。確定治療復(fù)合物相關(guān)劑量非常重要。參數(shù)選擇后，使用體內(nèi)小鼠模型，對(duì)體外確定的假設(shè)生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。使用移植物來源的新鮮凍存（FF）組織樣本對(duì)所選生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。圖4顯示相關(guān)安慰劑對(duì)照的抗- TWEAK 處理移植物小鼠潛在藥效學(xué)生物標(biāo)志物相關(guān)基因表達(dá)比率。研究發(fā)現(xiàn)，用藥后，基因表達(dá)降低。
 圖 2：9 種細(xì)胞系TWEAK受體基因表達(dá)。相關(guān)比率（log 2 量表）計(jì)算如下：ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以細(xì)胞系與時(shí) 間點(diǎn)作圖。進(jìn)行 ALAS1 與 HPRT1 標(biāo)準(zhǔn)化處理。 ACHN：人腎細(xì)胞腺癌 Caki：人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系 SJSA：人骨肉瘤；多源肉瘤 PANC-1：人胰腺癌；上皮樣細(xì)胞系 MDA-MB 231：人乳腺癌模型；乳房；乳腺；胸腔積液 AsPC-1：人胰腺腺癌 SK-MES-1: 人肺癌 NCI-H322M: 細(xì)支氣管肺泡腺癌 22RV1: 人前列腺癌移植片細(xì)胞系 |
反應(yīng)性預(yù)測(cè)（臨床反應(yīng)）生物標(biāo)志物可顯示：個(gè)體對(duì)治療性復(fù)合物是否會(huì)產(chǎn)生最佳反應(yīng)性（6）。著名事例：HER2/neu與Herceptin。
確認(rèn)潛在反應(yīng)性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，所選9種細(xì)胞系相關(guān)基因表達(dá)（參見圖 2）與小鼠模型移植腫瘤生長抑制之間具有相關(guān)性。1或24小時(shí)收集的細(xì)胞系為未處理細(xì)胞系，使用抗-TWEAK進(jìn)行小鼠處理。細(xì)胞系基因表達(dá)結(jié)果表明，重現(xiàn)性非常高，處理時(shí)間或培養(yǎng)對(duì)表達(dá)結(jié)果無影響。小鼠模型腫瘤生長抑制（TGI）與細(xì)胞系潛在生物標(biāo)志物相關(guān)基因表達(dá)之間相關(guān)性較高，見圖3。
 圖 3：細(xì)胞系中反應(yīng)性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物 1 基因表達(dá)與體內(nèi)腫瘤生長抑制(TGI)結(jié)果之間相關(guān)性較高。RealTime ready NF-κB 定制型多孔檢測(cè)板中基因表達(dá)結(jié)果與體內(nèi) TGI 作圖�！吧飿�(biāo)志物1”基因表達(dá)增加與 TGI 具有相關(guān)性。 |
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圖 4：體內(nèi)小鼠移植片模型中，抗- TWEAK 治療反應(yīng)與潛在生物標(biāo)志物 2 相關(guān)基因表達(dá)比率作圖。log 2 量表（n = 5 只動(dòng)物）基因表達(dá)中值作圖。我們使用的第一套臨床樣本來自于各種用于人類研究的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織。腫瘤來源的 FFPE 組織是臨床試驗(yàn)或生物標(biāo)志物研究中，治療復(fù)合物研發(fā)最具有相關(guān)性的樣本材料。使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒，從 FFPE 組織（例如：10um切片）中提取RNA，修訂操作方案見“材料與方法”
章節(jié)的描述，其后是特異性優(yōu)化與功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready RT-qPCR分析。
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A) 生物標(biāo)志物 3/腎隨機(jī)引物 |
B) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC隨機(jī)引物 |
C) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC特異性引物 |
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圖 5：潛在“生物標(biāo)志物 3”RealTime ready qRT-PCR 擴(kuò)增曲線。來自腎 RNA（A）與 FFPE 乳腺癌（BC）樣本（B 與 C）系列稀釋 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（A 與 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（C）進(jìn)行 PCR 啟動(dòng)。C中，使用特異性引物而不是隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成啟動(dòng)，以提高靈敏性。 | ||
FFPE研究樣本假設(shè)檢驗(yàn)中，可成功應(yīng)用RealTime ready RT-qPCR
檢測(cè)。已經(jīng)確立并對(duì)不同樣本工作流程方案進(jìn)行描述。使用
High Pure RNA Paraffin試劑盒，可從FFPE組織樣本中分離出RNA，
通過RealTime ready檢測(cè)，可進(jìn)行qRT-PCR分析。
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