張寶國　劉　騫
(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 龍井133400)

摘　要：RFLP是隨著生物技術(shù)若干領(lǐng)域的發(fā)展而產(chǎn)生的一種分子標(biāo)記技術(shù), 用該技術(shù)可作出 植物的RFLP圖譜，并應(yīng)用于植物遺傳和育種研究。本文簡單的對RFLP技術(shù)的基本原理、技術(shù) 步驟及其優(yōu)缺點作了簡單的概況。

　　關(guān)鍵詞： RFLP；作物研究；應(yīng)用 ��

　　中圖分類號： S5．032　文獻標(biāo)識碼：A  文章編號： 1008-7508（ 2007）03-0105-03

　　一、基本原理 ��

�� 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction end nuclease）能夠識別DNA雙鏈上特異的堿基序列并能 將之切斷。不同的限制性核酸內(nèi)切酶有各自特異的識別序列。在同源染色體相應(yīng)的DNA區(qū)段 ，用一種限制性核酸內(nèi)切酶消化，由于堿基組成不同，就會產(chǎn)生不同長度的酶切片段，然后 用標(biāo)記好的相應(yīng)的DNA探針與這些片段雜交，顯示出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列 組 成是否存在差異。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是通過限制性核酸內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性來揭示DNA堿 基序 列組成的異同，因而稱為限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，縮寫為RFLP）技術(shù)。

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　　二、RFLP技術(shù)的基本步驟 ��

�� 這一技術(shù)主要包括三大步驟：��

　　1、靶DNA的準(zhǔn)備  先將基因組DNA抽提出來，選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶解基因組DNA， 將酶解出來的具有各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳分離，使其按片段的長短排列，將D NA片段變性后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，稱印跡（Southernb1ot）轉(zhuǎn)移，并在80℃烘烤 或用長波紫外線照射，將DNA固定在膜上。��

　　2、核酸探針的標(biāo)記  將準(zhǔn)備作為探針的DNA片段純化（這些DNA片段可以是基因組DNA的 一個片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）標(biāo)記，經(jīng)純化后再用。��

　　3、雜交顯示  將標(biāo)記好的探針與硝酸纖維膜或尼龍膜上的單鏈核酸雜交，洗膜去除未雜交 的標(biāo)記探針后，進行放射自顯影或加入酶的底物進行顯色反應(yīng)，再對顯示出來的譜帶進行分 析。

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　　三、RFLP技術(shù)的優(yōu)點及注意的問題 ��

�� 　1、RFLP技術(shù)的優(yōu)點   ��

　　第一，標(biāo)記數(shù)目可以是無限的：RFLP揭示的是DNA水平自然變異，其數(shù)目幾乎是無限的。��

　　第二，大部分標(biāo)記為共顯性：表現(xiàn)RFLP的位點一般是單一序列，每個位點通常有兩個等位基 因(其顯性)。遵循孟德爾式遺傳，因而RFLP標(biāo)記圖也可用傳統(tǒng)的基因標(biāo)圖方法來構(gòu)建。��

　　第三，任何生育期都可預(yù)測，不受環(huán)境影響：DNA分子水平標(biāo)記沒有發(fā)育階段或器官的特異 性，不受環(huán)境條件及基因互作的影響。��

　　第四，高度變異性：每一植株都會有大量的多態(tài)性。通常只要有一次有性雜交，一個作圖群 體就能構(gòu)建一個較豐富的RFLP圖譜。��

　　2、在做RFLP分析技術(shù)時，有幾個問題是需要引起密切注意：��

　　第一，作為檢測對象的DNA分子必須保持大分子，在抽提DNA的過程中避免人為地將DNA分子 機械性切割成小片段的DNA，否則最終顯示的RFLP圖譜可能是一種假象；��

　　第二，在用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA時，要使DNA被完全消化，否則所得的結(jié)果也不可靠 ；��

　　第三，被消化的DNA濃度不能太高；��

　　第四，電泳時要用低壓電泳；��

　　第五，雜交前探針必須充分變性；��

　　第六，要根據(jù)探針標(biāo)記的情況以及探針與靶DNA間序列互補的程度和G、C的含量來掌握雜交 和洗膜的條件；��

　　第七，作放射自顯影時，要根據(jù)雜交后膜上的放射活性等因素決定曝光的時間。

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　　四、RFLP在作物遺傳育種上的應(yīng)用 ��

�� 　1、分子水平上選擇目的性狀��

　　RFLP圖本身對植物育種并沒有直接的用處，只有當(dāng)它與經(jīng)典標(biāo)記即原已定位的基因結(jié)合起來 才有用，當(dāng)確定哪一個RFLP標(biāo)記與目的性狀表現(xiàn)協(xié)同分離，即目的基因與RFLP的連鎖，使得 對期望基因重組型的選擇容易進行，在分子水平上選擇目的性狀，不受環(huán)境條件遺傳背景的 影響，RFLP連鎖圖譜為育種者們提供了一種高效選擇手段，在馬鈴薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麥類作物上已相繼出現(xiàn)RFLP作圖的有關(guān)報道。育種者們只要選擇 了與目的基因緊密連鎖的一個或多個RFLP標(biāo)記，也就選擇了目的基因，因為與目的基因連鎖 的RFLP標(biāo)記是易于檢測的。這種間接對那些直接選擇有困難或過于費時、費力的性狀以及在 分離群體中隱性性狀的選擇特別有效。在番茄中已鑒定的與RFLP標(biāo)記連鎖的基因，有番茄花 葉病毒、鐮刀菌、細菌斑和根結(jié)線蟲的抗性基因及控制植株生長習(xí)性(SP)和果實成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮桿花葉病毒抗性基因、萵苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP標(biāo)記。 ��

　　2、RFLP遺傳標(biāo)記與作物數(shù)量性狀基因定位��

　　在農(nóng)作物中有許多經(jīng)濟性狀都是由單個基因效應(yīng)微小的多基因控制且易受環(huán)境影響的數(shù)量性 狀，多年來對這類性狀的遺傳研究主要采用數(shù)量遺傳學(xué)的方法，通過適當(dāng)?shù)脑囼炘O(shè)計和統(tǒng)計 模型估算出平均數(shù)、方差、協(xié)方差、遺傳力、配合力等遺傳參數(shù)．用這些參數(shù)描述群體的遺 傳特征，對育種研究起了一定的指導(dǎo)作用，但對控制數(shù)量性狀的基因數(shù)目、數(shù)量性狀基因座 位(Quantitative Trait Loci簡稱QTL)在染色體上的位量，QTL各基因座位對數(shù)量性狀的貢 獻大小及其基因間關(guān)系等問題，則需RFLP檢測技術(shù)來研究。目前用高密度RFLP圖譜上的分子 標(biāo)記作為重要數(shù)量性狀，如產(chǎn)量、株高、果實及種子成分含量等QTL作圖，可望推出控制數(shù) 量性狀的多基因數(shù)目，確定QTL在染色體上的位置，測定單個基因的作用效應(yīng)。應(yīng)用分子標(biāo) 記定位QTL的過程是首先檢測、篩選親本并構(gòu)建遺傳群體，構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖，然后根據(jù) 統(tǒng)計模型及方法與QTL的連鎖關(guān)系及QTL在染色體上的區(qū)域等，達到定位QTL之目的。近年來 ，應(yīng)用RFLP標(biāo)記在番茄、玉米、水稻等作物中的QTL定位研究取得了可喜的成果，如水稻稻 瘟 病抗性多基因定位，番茄果重、可溶性固體含量、pH值QTL定位研究，控制玉米成熟性的QTL 分析等。��

　　3、進行品種或品系遺傳純度的測定��

　　對整個基因組中許多連鎖位點上RFLP圖譜的了解，則可對某一品種或純系進行基因型圖解， 以代表這一品系具有品種特異性，因此基因組中一些微小變異可以從RFLP圖譜的改變監(jiān)測出 來；所以RFLP圖譜技術(shù)還可用于種子專利登記中，解決侵權(quán)糾紛，在歐洲已為一些商業(yè)育種 者用來保護自己的品種權(quán)益。��

　　4、改良回交育種技術(shù)��

有性雜交育種就是將具目的性狀品種與待改良的品種進行雜交，其分離后代的染色體由雙親 的染色體片段鑲嵌而成，即帶有所需的親本性狀，也帶有不希望出現(xiàn)的親本性狀。回交育種 技術(shù)引入供體基因后，用以恢復(fù)親本原有優(yōu)良基因型的方法，通過多次回交選擇或回交、自 交選擇(目的基因為隱性)，就能得到遺傳上與受體親本相似，但加入了目的基因的植株�；� 交育種局限性在于時間長，目的基因為主效、易檢測，RFLP技術(shù)的出現(xiàn)可望克服回交育種的 局限，如欲轉(zhuǎn)移的基因與RFLP標(biāo)記緊密連鎖，則在幼苗期，即性狀尚未表達之前就可檢測目 的基因是否存在，并且利用RFLP技術(shù)，回交育種也可針對于數(shù)量性狀基因進行。��

　　5、建立不相容的作物間的遺傳關(guān)系，進行作物間基因組同源性的測定��

在分類學(xué)上，一些性不相容的作物有一定的親緣關(guān)系，如甘蘭、蘿卜、 白菜都屬蕓苔屬， 玉米、高粱都屬禾本科，馬鈴薯、番茄、辣椒等屬茄科，但對它們基因染色體組的同源性所 知甚少，如果染色體成分的基因順序在親緣種間是高度保守的，則有可能通過體細胞雜交或 外緣DNA導(dǎo)入等手段，替換單個染色體或染色體片段，將作物的優(yōu)良性狀及那些在一個種的 正常雜交范圍內(nèi)無法得到的基因組合到一起。利用同一套探針進行RFLP作圖，已測定了番茄 、馬鈴薯和辣椒的染色體組成和基因順序的保守程度，建立三者之間的比較連鎖圖譜，通過 比較番茄和馬鈴薯間高度連鎖保守，染色體有部分同源性，有可能進行染色體或片段交換， 而辣椒同源性差。

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　　五、問題與展望 ��

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　　RFLP技術(shù)結(jié)合到常規(guī)育種程序中，使人們能快速精確地獲得、轉(zhuǎn)移和組合基因。由于RFLP對 育種方法學(xué)的直接影響，RFLP探計的應(yīng)用將可能作為最先列入商業(yè)或政府育種計劃的生物技 術(shù)之一，也將成為對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響的第一批生物技術(shù)。但RFLP圖譜的可利用程度依賴于其飽 和水平，即片段數(shù)目和這些片段在染色組分布水平與所表現(xiàn)出的多態(tài)性水平，并且還要求某 一多態(tài)性特征與某一期望的表現(xiàn)型相連鎖。RFLP作圖計劃的目標(biāo)之一是建立“飽和圖”，所 有染色體每隔10～20個交換單位(cM)就有RFLP標(biāo)記，一個飽和圖要包含150個左右間隔均勻 的標(biāo)記，即必須用數(shù)以百計的探計作圖，才有可能達飽和水平，故而這項技術(shù)費用昂貴及放 射性同位素標(biāo)記存在問題，是目前RFLP技術(shù)普遍應(yīng)用的局限性。但將來發(fā)展簡便方法，用生 物素或酶標(biāo)記的DNA探計，費用將會降低。�オ�

參考文獻： ��

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