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本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ELISA法。用抗大鼠Insulin單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 Insulin與單抗結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測(cè)OD值，Insulin濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Insulin濃度。

1.          收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.          標(biāo)準(zhǔn)品第一次使用時(shí)用0.5ml的蒸餾水溶解，放置半小時(shí)混勻后使用，用后放在-20oC保存。溶解后濃度分別為14、8、3.2、1.6、0.8、0 ng/ml。

3.          標(biāo)本如果需要稀釋可以用蒸餾水稀釋。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

1.          建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔6孔，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul。

2.          加樣：待測(cè)品孔每孔各加入待測(cè)樣品50ul。

3.          每孔加酶標(biāo)抗體工作液50ul。將反應(yīng)板置37℃120分鐘。(室溫過夜可以提高靈敏度)

4.          洗板：同前。

5.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

6.          每孔加入100ul終止液混勻。

7.          30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

1.          所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。

2.          以標(biāo)準(zhǔn)品14、8、3.2、1.6、0.8、0ng/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)Insulin含量。

             1.   靈敏度：最小的Insulin 檢測(cè)濃度小于0.4ng/ml。

2.        特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的大鼠Insulin。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3.        重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

             1.   以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！