譯自= A novel assay for lnfluenza virus quantification using surfece plasman resanance. Vaccine 2010 Jan8:28(3)759-65

C. Estmer Nilsson 1, S.Abbas1, M.Bennem 1,

A.Lorssan 2, M.D. Hamalalnen 2, A. Frostell Karlssan 2

1 GE Heathcare BioScience AB, Bjorkgatan 30, SE-751 84 Uppsata,Sweden

2 GE Heathcare BioScience AB. Rapsgatan 23. SE-751 84 Uppsata Sweden

 

    利用單向放射免疫擴散法(SRID)來定量血細胞凝集素(HA)，是確保季節(jié)性流感疫苗的產(chǎn)品效力的主要方法。本文介紹了一種利用生物傳感器技術(shù)定量流感病毒的新方法。此方法通過將HlNl、H3N2和B型病毒的HA蛋白固定在傳感器芯片上，以抑制性分析的形式來定量病毒。初步結(jié)粟顯示這種分析與SEID相比，具有具有更高的靈敏度(檢測范圍0.5—10 ug/ml)和更高的精確度，并且能顯著降低了分析及手工操作時間。

 

    流感病毒疫苗的接種是降低季節(jié)性流感死亡率的基本策略。在開發(fā)和生產(chǎn)過程中流感疫苗的抗原含量主要是利用免疫化學(xué)法定量血細胞凝集素(HA)來確定的。單向放射免疫擴散法(SRID)其中最常用也是最重要的方法。自1978年以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的所有人滅活流感病毒疫苗的效力加的效力都是用SRID來確定的。同時，它還是世界衛(wèi)生組織(WHO)和歐洲藥品管理局(EMEA)的推薦方法[1-3]。然而，除了非常耗費勞力，這種方法還有一些其它缺陷，如準確性低、精確度和靈敏度也低[4]。

 

    到目前為止，流感疫苗主要是利用雞胚來生產(chǎn)的。然而，對流感病毒新近爆發(fā)的恐慌讓人們著手利用細胞門著手利用細胞培養(yǎng)來更有效地生產(chǎn)疫苗。這種工藝開發(fā)急需新的靈敏而簡單的分析工具。

 

    目前已有多種不同的針對流感病毒的定量和檢測方法見諸報道：酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)[5-7]。神經(jīng)氨酸酶(NA)活性分析[8,9]，HPLC法[10-12]，血凝分析[11,13]，以及定

量PCR(qPCR)[14-16]。其中一些方法與SRID相比，靈敏度有所提高。然而，除了多重定PCR，這些方法都不能減少手工操作時間，也不能在單個實驗中同時定量三種不同亞型的HA。然而，鑒于qPCR必須經(jīng)過將RNA轉(zhuǎn)化成DNA的反轉(zhuǎn)錄步驟，因而相比起定量qPCR更適合用于流感病毒及分型上。Williams等[17]展示了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合同位素稀釋，用于病毒蛋白的絕對定量。此方法的優(yōu)勢在子能在一個實驗中分析三價疫苗，而且降低了對參照抗原和血清的需求量。然而，由于確定HA濃度的獨立參考標準無法得到，也就無法與SRID測定進行直撞的比較。此外，這個方法還需要在分析前制備樣品[17]。

 

    過去也有利用表面等離子共振(SPR)來檢測并定量流感病毒的報道，這些全是基于直接的結(jié)合方法[18-25]。這些研究要么測定HA與它的唾液酸受體結(jié)合的動力學(xué)[20,22]，要么測定抗體與HA和NA的親和力[18,19,21]。或者描述HA的RNA適體（aptamer）篩選[23]。其中一篇報道介紹了在處理樣品和疫苗中定量流感病毒的方法[25]。這種方法利用唾液酸型化臺物作為多種病毒株通用的弱親和力配體，分析范圍在10-100 ug/ml。它利用了持續(xù)的弱親和力生物傳感方法來避免了再生的需要，并減少了分析時間[25]。小型化的生物傳感器也經(jīng)過

    禽流感病毒檢測的測試，特定抗原的檢測極限在5 ug/ml[26]。盡管這些基于SPR的方法縮短了手工操作時間，但它們并不比SRID更靈敏，也無法同時分析三種病毒株。

    在此我們介紹一種新方法，利用表面等離子共振以抑制分析的形式準確定量流感病毒。重組的HA蛋白[27](分別為A/H1N1,A/H3N2和B)固定在傳感器芯片的葡聚糖基質(zhì)上，隨后讓病毒抗原和血滴混合液中針對三種流感類型特異的游離抗體與表面的HA蛋白結(jié)合，產(chǎn)生響應(yīng)的變化(圖1)。樣品中病毒濃度越高，殘余抗體結(jié)合響應(yīng)就越低。重組HA蛋白固定在同一塊芯片表面的三個不同流動槽內(nèi)，這樣就能在同一實驗中分析三價疫苗。研究表明生物傳感器分析是可靠的．與SRID相比回收率、精確度和靈敏度更高，而分析時間更短。校準曲線范田是0.5-10 ug/ml,所有三種亞型(A/H3N2、AHlNl和B)的檢測極限預(yù)計低子0.5 ug/ml。由于此方法中的參照抗原和血清與當(dāng)前疫苗效力檢測方法中所使用的相同。這種新方法有可能取代或者補充SRID，成為未來的流感疫苗的定量方法。

 

    材料和方法

    對照血清(綿羊)和病毒抗原購自英國NIBSC，除了B/Brisbane/3/2007血清和抗原來自荷蘭Solvay Phormaceuticols，PR/B/34血清(雞)和病毒是購自美國Charles River Laboratories。重組的全長HA蛋白(A/H1N1/New Caledonia/2O/99、A/H3N2/Wyaming/3/2003和B/Jilin/20/2003)分別購自以色列PraspecBio、荷蘭Genway和美國Protein Sciences。表4中分析的工藝樣品來自瑞典通用電氣醫(yī)療集團，除了B/Brisbane/3/2007 MBV和TBV)樣品以及A/H1N1/Salamon Islands/3/200 TBV樣品是由荷蘭Solvay Pharmaceuticals提供的。三價疫苗購自三家制造商。覆面活性劑P2O(polyoxyethglenesorbitan)、HBS-EP+緩沖液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05％表面活性劑P2O)、氨基偶聯(lián)試劑盒、Cy3-染料、瓊脂糖和DNA均來自通用電氣醫(yī)療集團。牛血清白蛋白(BSA)購自Pierce，DMEM購自Invitrogen，蔗糖、NaCl和兩性洗滌劑Zwittergent購自默克。

 

    所有分析都使用了Biacore TM l00系統(tǒng)和CMS傳感器芯片(通用電氣醫(yī)療集團)。相互作用研究是基于金表面的表面等離子共振檢測，再結(jié)合處理試劑的微流體系統(tǒng)。生物分子之間的相互作用以非標記分析形式實時監(jiān)控。相互作用分子中的一方固定在傳感器表面的半流體葡聚糖基質(zhì)上。另一個分子隨后注入到流經(jīng)傳感器表面的溶液中。當(dāng)注入樣品中的分子與固定在傳感器表面的相互作用配體結(jié)合時，即可檢測到SPR響應(yīng)的變化。響應(yīng)水平的變化與表面上質(zhì)量的變化成正比。此方法設(shè)定為抑制分析(圖1)，以避免大的病毒分子的擴散影響[28]。樣品無需預(yù)處理就能分析。HBS-EP+作為分析緩沖液。采用標準的胺偶聯(lián)步驟[29]，注入50-80 ul重組HA(10 ug/ml)從而將重組HA蛋白固定在7000-10000個響應(yīng)單位(RU)，條件分別為l0 mM馬來酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 6.5)(HA/H1Nl l5分鐘,HA/H3N2 7分鐘),或者在10 mM磷酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 7.0)。(HA/B 20分鐘)。

 

    對抗流感血清進行滴定，以在400s注射時間內(nèi)在各自對應(yīng)的表面上產(chǎn)生700-l400個RU的響應(yīng)。將病毒參照抗原混合物，或未知濃度的病度樣品，與固定稀釋度的抗流感血清混合，在400s內(nèi)注入表面。隨后利用50 mM HCl、或者0.05％Surfactant P2O再生表面(30s)。注射樣品中的游離抗體與表面的HA結(jié)合。產(chǎn)生響應(yīng)(圖1)。每次分析時先進行5-10次只有血清和再生步驟的啟動循環(huán)，以穩(wěn)定表面。在每次分析開始、中間和結(jié)束時均分析血清和參照抗原的校準曲線。為了在分析過程中根據(jù)校準曲線的改變而調(diào)整，將三個校準曲線中的四個參數(shù)回歸的換算系數(shù)用于生物傳感器軟件的原型功能性的標準化。因此每個樣品得到一組獨特的校準曲線系數(shù)，用于樣品濃度的計算。

 

    在微滴定板中制備標準品和樣品，樣品體積40-80 ul，分析一股以無人值守的模式過夜運行(96個樣品/標準品約15個小時)。

    可靠性測試所使用的添加劑為DNA、BSA、DMEM、蔗糖和NaCl，如表3所示。

    在三價分析中，HAA/H1Nl、A/H3N2和B固定在同一塊芯片的三個不同通道中(圖7)。首先將三個特定的參照抗原與血清(A/H1N1/Solomo Islands、A/H3N2/Wiscansin、B/Malaysia)混合，以形成三價的校準曲線抗原和三價血清。樣品隨后穿過三個表面，在一個實驗中同時分析三個毒株。

按照制造商所提供的SRID滴度按比例稀釋血清亞型特異性研究，以評估血清親和力的差異。

 

 

表1 計算濃度和變異系數(shù)，以分析B/jiangsu/10/2005(圖3)

   

    血清以Cy3-染料標記。未標記的血清和Cy3-標記的血清（小于總血清量的0.5％；證實不會干擾沉淀)與熔化的瓊脂糖混合，澆鑄在模中，以形成凝膠中的孔。樣品和參照抗原在加入凝膠孔之前，用1％的兩性洗滌劑Zwittergent在-22處理30分鐘。凝膠在-22 15-18個小時，隨后干燥，并在Typhoon的450nm下掃尾。利用ImageQuant TL軟件將樣品的環(huán)狀區(qū)與參照抗原比較，從而進行評估。儀器和軟件皆來自通用電氣醫(yī)療集團。

 

    圖2分別顯示了三個分析(B、H3N2和HlNl)的典型校準曲線。校準曲線的動態(tài)范圍優(yōu)化到0.5-10 ug/ml產(chǎn)生的回收率在98-102%。根據(jù)參照抗原的連續(xù)稀釋(低至0 ug/ml)，所有三種亞型的檢測極限預(yù)計低于0.5 ug/ml，定量極限約1ug/ml。圖1顯示了在重組HA表面上重復(fù)注射不同濃度（0.5-16 ug/ml)的B/Jiongsu/10/2005血清和抗原后的相對響應(yīng)。計算出的濃度顯示在表1。

 

    曾提到響應(yīng)會隨時間而降低，這在最初10-20個循環(huán)中最大，之后隨循環(huán)數(shù)增加而穩(wěn)定。所有待測的參照抗原在個自的表面也檢測到類似的結(jié)果，改變再生條件或者用去污劑預(yù)處理樣品也不會對其產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)。為了增加分析的準確性，運行了三個校準曲線，樣品濃度是由差值校準曲線來確定的，如第2部分所示。

 

    為了研究針對不同毒株的血清與表面上重組HA蛋白之間相互作用的特異性，在所有三個表面上分析了不同毒株的抗血清(圖4)。血清在參照抗原(2 ug/ml)和無參照抗原下進行檢測，以確認反應(yīng)是相應(yīng)病毒所特異的，以及病毒本身不會產(chǎn)生非特異的背景影響。結(jié)果表明固定在表面的三種重組HA蛋白分別是三類亞型A/H1N1、A/H3N2和B血清所特異的，而對于同亞型病毒內(nèi)的毒株之間則是通用的。所有血清中只有一種能與所有表面結(jié)合(雞/H1N1/PR/8/34血清，數(shù)據(jù)末顯示)。其中的原因目前未知�？赡苁请u來源的成分引起了非特異響應(yīng)，而其它血清都來自綿羊。

 

    為了擴展特異性研究，對27種不同的血清與固定了HA/H3N2的表面之間的結(jié)合進行分析(圖5、表2)。結(jié)果顯示只有特異針對H3N2亞型的血清才能與表面明顯結(jié)合。抗-B和抗-H1N1血清顯示出低的結(jié)合水平。相應(yīng)地，利用50 mM HCl、0.05％ P2O再生后，也開展了27種血清與固定了HA/B和HA/H1N1的表面結(jié)合的實驗。結(jié)果顯示只有抗-B和抗-H1Nl血清分別明顯結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。

 

 

 

    圖5 27種不同血清(表2中詳細說明)在固定了重組HA/H3N2的傳感器芯片上的響應(yīng)。A/H3N2血清毒株的結(jié)合以實心菱形標出，A/H1N1血清毒株以空心菱形標出，B毒株以空心正方形標出。用50 mM HCl和0.05％ P2O再生表面。血清1和2重復(fù)分析兩次，以監(jiān)測響應(yīng)偏差。

    開展初步分析以探索毒株特異性。在固定了重組HAA/H3N2/Wyoming的傳感器芯片上運行校準曲線，該曲線有著標準品和血清的四個可能組合，針對隨機選擇的H3N2毒株Wyoming和New York(圖6A)。最低濃度的響應(yīng)水平范圍在1700-2000個RU。為了利于比較，將各個曲線的每個響應(yīng)除以最低濃度(以％表示)，來標準化響應(yīng)。曲線以N.Y/N.Y、N.Y/W、W/W和W/N.Y的順序運行。W/W組合在另一塊有著相似固定水平的芯片上重復(fù)運行4次，提供實驗差異的參考數(shù)據(jù)(圖6B)。結(jié)果顯示所有W/W組合的抑制實現(xiàn)了最高的靈敏度。結(jié)果還表明，就這兩個毒株而言，如果用New York標準品和血清來定量Wyoming樣品，合獲得過高的計算濃度值。

 

    在疫苗純化過程中，各個步驟的樣品有著不同的純化圖，可能會含有影響濃度分析的化合物。為了研究分析中添加劑的影響，分析前在參照抗原中加入了BSA、-DNA、細胞培養(yǎng)基、蔗糖和鹽。結(jié)祟顯示在表3。BSA、-DNA和細胞培養(yǎng)基不影響分析。鹽和蔗糖降低了響應(yīng)，顯著增加了表觀濃度：然而這些添加劑的影響可用稀釋處理來避免。研究發(fā)現(xiàn)1<％的蔗糖和<0.2 M的NaCl對于可靠定量是理想的。還重復(fù)運行了含有55 ug/ml純化的A/H1N1/Solomon slond的對照樣品，以研究準確性。在一個分析(一塊芯片/凝膠)內(nèi)，生物傳感器方法的內(nèi)部CV為2％(5次重復(fù))，而SRID為9％(12次重復(fù))。兩個操作員在不同時間所做的不同分析之間，生物傳感器方法的內(nèi)部CV為5％(3次分析)，而SRID為18％(5次分析)。

 

    為了測試生物傳感器方法的性能，對流感疫苗純化過程中不同階段的樣品進行了分析，從收集的細胞培養(yǎng)上清到過濾終產(chǎn)物。同一個樣品還用SRID分析以進行比較。結(jié)果匯總見表4。樣品經(jīng)過稀釋，這樣一般每個樣品的兩次稀釋能達到標準曲線范圍內(nèi)的濃度。每個樣品重復(fù)兩次，并計算出每次稀釋的變異系數(shù)(CV)。對于大部分樣品，兩種方法的結(jié)果有著良好的一致性，但生物傳感器測定與SRID相比，兩次重復(fù)之間的CV要低得多且靈敏度更高。對于少數(shù)HA濃度高(>100 ug/ml)的樣品，線性稀釋很難實現(xiàn)。不過，這是生物傳感器和SRID兩種方法都有的，因此可認為源于樣品，而不是稀釋本身。

 

 

    Biocore T100可將樣品連續(xù)注射在四個流動槽中，每個流動槽有著獨立的傳感器表面。為了在同一個實驗中分析三價疫苗，三個流動槽的傳感器表面分別固定了HAA/H1Nl、A/H3N2和B。利用參照抗原和特異抗血清的三價混合物對來自三家制造商的疫苗進行分析(圖7)。疫苗同時用SRID分析(在三塊不同的凝膠上)。SRID和生物傳感器方法的測定仍然很相似，且生物傳感器方法的重復(fù)實驗精確度更高。生物傳感器方法的總分析時間為9小時，手工操作為1-2小時。而SRID分析的總時間為22個小時，手工操作為6-8小時。

 

 

 

 

 

 

    在本文中，我們展示了一種新穎的定量HA的生物傳感器方法的開發(fā)和初步結(jié)果，它利用了與SRID方法相同的參照抗原和血清，再加上固定的HA。

 

    來自不同供應(yīng)商的重組HA蛋白經(jīng)過固定化的測試，并根據(jù)固定性質(zhì)(如活性和直接稀釋到固定緩沖液的高濃度)進行挑選(數(shù)據(jù)未顯示)。挑選出的蛋白可利用標準的氨基偶聯(lián)步驟，在接近中性(pH 6.5-7.0)的緩沖液中輕松地進行固定化。其它蛋白固定化試劑，如通過活性二硫化物[29]或蛋白上引入的醛基來偶聯(lián)，也能產(chǎn)生活性表面，只是隨時間的穩(wěn)定性比胺偶聯(lián)方法所獲得的稍遜(數(shù)據(jù)未顯示)。除了利用表面上的重組HA，初步研究顯示單價疫苗(MBV)，特別是亞基或裂解疫苗，也可以固定并得到相似的定量結(jié)果(數(shù)據(jù)在別處顯示)。MBV可能成為表面物質(zhì)的更可靠來源，因為疫苗制造商會在年度生產(chǎn)中確保其供應(yīng)量。

 

    用較早期的血清來獲得初步定量的可能性。亞型特異性分析結(jié)果以及定量的高度準確性(或許這更為重要)  (圖3，表1和4)表明再生不會分析性能產(chǎn)生負面影響。利用這種再生，經(jīng)歷>100次樣品/標準品處理也依然可以保持其對所有三種亞型足夠的結(jié)合活性從而進行可靠地定量。表面活性劑P2O(Tween 20)包含在所有溶液中，因為已知它能在不影響相互作用分析的前提下防止蛋白吸附在流動系統(tǒng)中，從而使原始樣品得以進行分析。而且，研究表明非離子型去污劑的添加有助于防止HA聚集[33]。針對H3N2利用兩個隨機選擇的毒株(New York和Wyoming)來簡單研究其毒株特異性。正如由遺傳差異所得預(yù)期，兩種血清和參照抗原對另一毒株表現(xiàn)出不同的結(jié)合模式(圖6)。當(dāng)抗原和血清都是Wyoming時，此組合所獲得的靈敏度最高。這反映出這些試劑比NewYork試劑具更高的親和，從而導(dǎo)致對表面結(jié)合產(chǎn)生更有效的抑制，而不是因為固定的HA是Wyoming。采用與分析樣品毒株不同的參照抗原和血清，可獲得不同的絕對濃度。不過，工藝開發(fā)中產(chǎn)量的比較并不一定需要絕對濃度�？梢酝ㄟ^進一步研究來探索毒株間的遺傳相近性所決定的這種差異的相關(guān)性。蔗糖(>1％)和氯化鈉(>0.2 M)在可靠性測試中確實干擾了所測量到的響應(yīng)。蔗糖和鹽濃度升高，響應(yīng)降低(使HA濃度計算值增加)。已知在超出生理條件下鹽濃度的增加會削弱抗體與抗原的結(jié)合。在疫苗純化過程中，常使用蔗糖梯度和層析柱，獲得蔗糖>40%、NaCl>0.5 M的樣品，然而由于這些樣品中的病毒濃度也很高(>200 ug/ml)，因此可通過稀釋過程來避免這種附加效應(yīng)。季節(jié)性流感疫苗應(yīng)當(dāng)富有三種不同的流感病毒株(H1N1、A/H3H2和B)的每種各15 ug的血細胞凝集素。為了用SRID方法來分析三價季節(jié)性流感疫苗半成品和最終產(chǎn)品，疫苗制造商必須進行三次單獨的分析。有了生物傳感器方法，就能夠在單個實驗中定量疫苗中的三種不同毒株(圖7)，讓三價疫苗的批次放行更加有效。此外，與SRID相比，生物傳感器方法顯示出更高的回收率和測量精確度。精確度更高，將有可能減免過高疫苗劑量的需要。

 

    綜上所述，本文展示的初期數(shù)據(jù)表明，與SRID相比，生物傳感器方法具有高準確性及更高的靈敏度和精確度，同時可顯著減少的分析和手工操作時間。將這種方法擴展到固定化亞基、裂解甚至整個病毒疫苗的形式，將會開創(chuàng)定量方法的更廣泛應(yīng)用，包括表位定位和動力學(xué)分析等基礎(chǔ)研究。