Evelyn Goh
Waters Pacific, Singapore

應(yīng)用優(yōu)勢
此方法可同時分析 12 種水溶性維生素：

• 替代耗時的單一化合物微生物測定法。
• 在復(fù)雜基質(zhì)中如嬰幼兒配方奶粉里檢測低濃度目標(biāo)物 ( 尤其是維生素 B12) 。
• 一次分析便可同時獲得 MRM 和 全掃描數(shù)據(jù)。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC® 系統(tǒng)
Xevo® TQ MS
MassLynxTM 軟件
TargetLynxTM 應(yīng)用軟件
IntelliStart™ 技術(shù)
RADAR™

關(guān)鍵詞
水溶性維生素，維生素 C 、 B3 、 B6 、 B12 、 B1 、 B9 、 B2 、 B7

簡介
維生素是一種微量元素，由于人體內(nèi)無法對其進(jìn)行合成，只能通過食物攝取。嬰幼兒配方奶粉中的維他命元素對嬰幼兒的健康成長尤為重要，尤其對無法進(jìn)行母乳喂養(yǎng)、將配方奶粉作為主要營養(yǎng)來源的嬰兒而言。官方的水溶性維生素檢測方法以程序化為基礎(chǔ)，主要是微生物鑒定法，此方法已使用了近十年。為達(dá)到提取目的，需對每種維生素都進(jìn)行單獨(dú)分析，進(jìn)而測定其在食物里的總含量。這通常需耗費(fèi)大量時間。

使用一種檢測方式同時分析添加營養(yǎng)元素的嬰幼兒配方奶粉中的維生素十分困難，原因在于：

• 維生素結(jié)構(gòu)多樣，化學(xué)成分復(fù)雜
• 維生素含量低
• 基質(zhì)復(fù)雜
• 光和熱下不穩(wěn)定
• 溶解性問題
• 配方奶粉中濃度范圍廣

在此應(yīng)用文獻(xiàn)中，我們將介紹一種只需五分鐘的快速 UPLC®/MS/MS 質(zhì)譜檢測法，利用 ESI 正模式同時檢測嬰幼兒配方奶粉中的 12 種水溶性維生素。

實(shí)驗(yàn)
在樣品準(zhǔn)備和分析階段，所有溶劑均儲存在低于 5˚C 的避光處。維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液每日制備。

液相條件
LC 系統(tǒng)：           ACQUITY UPLC 系統(tǒng)
色譜柱：            ACQUITY UPLC HSS T3 ，
                        2.1 x 50 mm ， 1.8 μm
色譜柱溫度：     40 °C
樣品溫度：        4 °C
流速：               0.6 mL/min
流動相 A ：        10 mM 甲酸銨 + 0.1%
                        甲酸水溶液
流動相 B ：        10 mM 甲酸銨 + 0.1%
                        甲酸甲醇溶液
梯度：

總運(yùn)行時間：    5.0 分鐘
注入量：          10 μL ，全充滿定量環(huán)

質(zhì)譜條件
MS 系統(tǒng)：         Xevo TQ MS
離子化：           ESI+
毛細(xì)管電壓：  1.0 kV
源溫度：          150 °C
脫溶劑溫度：  600 °C
脫溶劑氣：       1200 L/ hr
采集：              多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)
                       及 RADAR 全掃描
碰撞氣：          氬氣 3.5 x 10-3 mbar

標(biāo)準(zhǔn)添加法
當(dāng)無法獲得空白試樣時，嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的定量分析將通過標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行， ( 煙酰胺除外 )* 。在試樣中添加已知濃度 ( 標(biāo)準(zhǔn)溶液 ) 的分析溶液，使任何基質(zhì)效應(yīng)都可在校準(zhǔn)時消除。分析員最初并未知道試樣中分析物的含量，但可對加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量以及加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后儀器響應(yīng)的變化進(jìn)行追蹤。因此，通過校準(zhǔn)曲線外推法可測定試樣中分析物的濃度。實(shí)踐中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加體積需保持在少量水平，以避免樣品基質(zhì)的稀釋。

* 試樣基質(zhì)使用現(xiàn)有稀釋系數(shù) ( 見實(shí)驗(yàn)步驟 ) ，無標(biāo)準(zhǔn)品添加，儀器對嬰幼兒配方奶粉中煙酰胺 (B3) 的響應(yīng)接近檢測器飽和值。如果標(biāo)準(zhǔn)添加法用于煙酰胺，將使檢測器達(dá)到飽和。

試樣準(zhǔn)備、萃取和標(biāo)準(zhǔn)添加
按嬰幼兒配方奶粉包裝說明上的三倍濃度進(jìn)行制備。

將 10 毫升嬰幼兒配方奶粉溶液放入用箔覆蓋的聚丙烯 (PP) 管中；加入 20 毫升 100% 濃度的乙醇。

搖晃混勻 2 分鐘，以 3500 RPM 的速率離心 15 分鐘。

上清液用 0.45μmPVDF 濾膜過濾。

將 20μL 上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶，加入 10μL 含 11 種分析物的已知標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，樣品瓶加水至 1 毫升 ( 將試樣基體中的分析物稀釋 50 倍；標(biāo)準(zhǔn)溶液中的分析物最終稀釋 100 倍 ) 。

溶液中煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線單獨(dú)制備。

通過 LC/MS/MS 進(jìn)行分析。

采集和數(shù)據(jù)處理方法
通過 MassLynx 軟件 v.4.1 版本獲取數(shù)據(jù)，使用 TargetLynx 應(yīng)用管理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
使用 IntelliStart 技術(shù)對 12 種目標(biāo)維生素進(jìn)行自動 MRM 采集方法優(yōu)化。 IntelliStart 只需輸入復(fù)合物的基本信息，即可自動找到母離子，優(yōu)化錐孔電壓，找到子離子并優(yōu)化碰撞能量。

每種維生素的 2 個 MRM 通道均已得到優(yōu)化；第一個通道為定量離子通道，第二個通道為定性離子通道。通道的駐留時間自動得到優(yōu)化，每個色譜峰最少有 12 點(diǎn)以保證定量重現(xiàn)性。分析物的 MRM 通道、錐孔電壓、碰撞能量、以及保留時間詳見下表 1 。

表 1. 檢測水溶性維生素的 LC/MS/MS 參數(shù)

除 MRM 數(shù)據(jù)外，使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式可獲得全掃描數(shù)據(jù)。 RADAR 是一種可獲得豐富信息的采集方法，獲取 MRM 數(shù)據(jù)的同時可實(shí)時獲取試樣基質(zhì)的背景質(zhì)譜信息。使用 RADAR 不會影響 MRM 數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

結(jié)果與討論
ACQUITY UPLC 系統(tǒng)結(jié)合 Xevo TQ MS 的 ESI 正離子模式成功分析了 12 種水溶性維生素。使用 ACQUITY UPLC 可在 5 分鐘內(nèi)快速分離所有分析物，包括 1 分鐘平衡時間，詳見圖 1 。

在同一分析檢測中，使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式監(jiān)測嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)中化合物的全掃描質(zhì)譜信息。 RADAR 利用 Xevo TQ MS 的快速采集速率獲取全掃描 MS 數(shù)據(jù)，且同時在 MRM 模式下得到足夠的分析物峰點(diǎn)數(shù)，以準(zhǔn)確定量和定性。

通過 RADAR 可觀察試樣基質(zhì)中的雜質(zhì)，并了解可能造成基質(zhì)效應(yīng)的化合物含量和類別。這對 LC-MS/MS 方法開發(fā)過程中優(yōu)化方法以降低基質(zhì)影響帶來幫助。例如，可通過調(diào)整分離方法使得目標(biāo)峰與可能引起基質(zhì)影響或離子抑制的區(qū)域分離。圖 1 中插入部分為從嬰幼兒配方奶粉試樣基質(zhì)全掃描數(shù)據(jù)中提取的質(zhì)譜圖。

此方法檢測了兩種不同大眾品牌的嬰幼兒配方奶粉。圖 2 顯示的是從其中一種品牌里提取的水溶性維生素定量離子色譜圖。

回收率與重現(xiàn)性
通過比較提取前加標(biāo)樣品和提取后加標(biāo)樣品得到回收率。實(shí)驗(yàn)分兩天檢測兩種不同品牌的嬰幼兒配方奶粉，每日重復(fù)進(jìn)行 6 次。
每種嬰幼兒配方奶粉的大部分化合物都達(dá)到了 ≥90% 的提取回收率，吡哆醛、葉酸和核黃素 -5’- 磷酸除外，回收率相對較低的主要原因是上述物質(zhì)的水溶性較差。
盡管嬰幼兒配方奶粉是一種非常復(fù)雜的基質(zhì)， 6 個重復(fù)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSDs) 仍然都低于 5% 。這顯示了該方法的高重現(xiàn)率以及穩(wěn)定性。

線性和定量
線性動態(tài)范圍、靈敏度和適合性可通過標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行評測。標(biāo)準(zhǔn)添加法的一大優(yōu)勢是可避免測定基質(zhì)效應(yīng)，消除離子抑制的影響。
得到相關(guān)系數(shù) ≥0.99 的較好線性關(guān)系，如表 3 所示，所有進(jìn)行分析的嬰幼兒配方奶粉濃度范圍不同：抗壞血酸（ C ）為 10 - 10000 ng/mL ；氰鈷胺（ B12 ）為 0.1 - 10.0 ng/mL ；其余分析物為 1 到 100 ng/mL 。數(shù)據(jù) 3 顯示的是以標(biāo)準(zhǔn)添加法為基準(zhǔn)的一種嬰兒配方奶粉抗壞血酸（ C ）和氰鈷胺（ B12 ）的校正曲線。

圖 3. 使用標(biāo)準(zhǔn)添加法的 A 配方奶粉的抗壞血酸和維生素 B12 校正曲線。

校正曲線為外推法，由于考慮到稀釋因素 (50 x) ， x 軸截距絕對值顯示嬰幼兒配方奶粉中分析物的濃度。 Xevo TQ MS 的靈敏度讓我們可稀釋樣本以降低基質(zhì)效應(yīng)，同時仍可檢測到目標(biāo)化合物。

結(jié)論

一個使用 ACQUITY UPLC 與 Xevo TQ MS ESI 正模式 5 分鐘快速測定法，用于同時分析 12 種水溶性復(fù)合維生素。此法替代了耗時的維生素單獨(dú)分析法。通過將不同維生素分析法融為一體，實(shí)驗(yàn)室可提高試樣分析量、減少容積消耗、降低運(yùn)作成本。

Xevo TQ MS 的高靈敏度可實(shí)現(xiàn)在非常復(fù)雜的基質(zhì)中檢測低濃度目標(biāo)分析物 ( 尤其是氰鈷胺 ) ，如嬰幼兒配方奶粉。 Xevo TQ MS 可達(dá)到低定量限，稀釋試樣來降低基質(zhì)效應(yīng)。

RADAR 技術(shù)可監(jiān)測基質(zhì)干擾，雜質(zhì)和樣品中的降解物，同時準(zhǔn)確定量目標(biāo)分析物。分析員在檢測基質(zhì)效應(yīng)時便可做出準(zhǔn)確決策，并可準(zhǔn)確評價基質(zhì)效應(yīng)是否有存在。

IntelliStart 技術(shù)簡化系統(tǒng)準(zhǔn)備和 MRM 方法開發(fā)，確保所有層次的科學(xué)家均可快速準(zhǔn)確地操作儀器，生成最高質(zhì)量的可重現(xiàn)的 UPLC/MS/MS 數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1. AOAC Official Method 985.32, Microbiological Method for Analysis of Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in Ready-to-feed Milk-based Infant Formula.
2. AOAC Official Method 992.07, Microbiological Turbidimetric Method of Pantothenic Acid in Milk-based Infant Formula.