試劑和器材:
1. 過氧化物儲(chǔ)存液:30mmol/L過氧化氫儲(chǔ)存在T-牛血清白蛋白(Tris-牛血清白蛋白溶液)中;
2. 樣品緩沖液:2體積的T-牛血清白蛋白溶液+1體積的2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100;
3. 鈦氧硫化物(2.25g/L)溶于1mol/L硫酸中;
4. T-牛血清白蛋白:20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0),含1g/L牛血清白蛋白;
5. 微量離心機(jī),帶2.0ml微量離心管;
6. 分光光度計(jì);
實(shí)驗(yàn)方法:
原代細(xì)胞培養(yǎng)后,所有操作都在2ml微量離心管中,置于冰上進(jìn)行,所有溶液也保持在冰浴環(huán)境下。
1. 新鮮制備待測混合物,將8.5ml過氧化物儲(chǔ)存液用T-牛血清白蛋白溶液稀釋至100ml;
2. 向0.5ml測定混合物中加入1.0ml鈦氧硫化物,在405nm波長下測定吸光度,應(yīng)該約為1.5.如果不是,就相應(yīng)地調(diào)整過氧化氫的濃度;
3. 將10μl樣品與30μl樣品緩沖液相混合,反應(yīng)對照液使用40μl樣品緩沖液;
4. 所有管子中都加入0.5ml待測混合物,每批只操作6管;
5. 準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1min后,加入1.0ml的鈦氧硫化合物,用微量離心機(jī)以13500g離心2min;
6. 所有管都在室溫達(dá)到平衡后在405nm波長處測量吸光度,空白樣含有0.54ml T-牛血清白蛋白和1ml鈦氧硫化合物;