用差速離心法從大鼠肝臟中分離原代細(xì)胞重線粒體組分

試劑和器材
1. 甘露醇緩沖液：0.2mol/L甘露醇、50mmol/L蔗糖溶液、10mmol/L KCl、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
2. 玻璃棒；
3. Dounce勻漿器（20—30ml寬松配制，Wheaton B型）；
4. 高轉(zhuǎn)矩橋式電動(dòng)機(jī)（半導(dǎo)體開關(guān)控制）；
5. 高速離心機(jī)，配有可容納40—50ml離心管的固定角轉(zhuǎn)子低速冷凍離心機(jī)；
6. Potter-Elvehjem勻漿器，20—40ml間隙為0.07mm；
7. 注射器（內(nèi)徑約0.8mm），帶金屬套管針；

實(shí)驗(yàn)方法：
   所給體積適用于約10g的肝臟。第6步以后所有操作須在0—4℃下進(jìn)行。
1. 對一雄性大鼠過夜禁食，使其糖原耗盡；
2. 頸椎脫臼法處死大鼠，迅速切除肝臟并稱重；
3. 將肝臟轉(zhuǎn)移到置于冰上的燒杯中，用剪刀小心地剪碎（肝臟碎片的大小不得超過3mm3），然后用甘露醇緩沖液混懸（每克肝臟使用約4ml緩沖液）；
4. 將一半的液體和組織碎片倒入Potter-Elvehjem勻漿器，用研杵上下研磨5—6次（旋轉(zhuǎn)速度約為700r/min），另一半的樣品也重復(fù)該操作；
5. 將勻漿液平分到2個(gè)離心管中，并于1000g離心10min；
6. 傾倒上清后，放置在冰上。取30ml緩沖液重懸沉淀，用Potter-Elvehjem勻漿器的研杵研磨2—3次進(jìn)行勻漿，并重復(fù)步驟5操作；
7. 傾倒后合并上清，再于1000g離心10min；
8. 用連在20ml注射器的金屬套管針去除上清；
9. 4000g離心上清15min；
10. 用金屬套管針和注射器去除4000g離心所得上清。為盡可能除去上清，針頭盡量靠近凹液面；
11. 同樣將致密的棕色沉淀上堆積的疏松粉紅色物質(zhì)小心地吸出，用紙片擦拭管內(nèi)壁以去除附著液體；
12. 每管加入10ml緩沖液，用玻璃棒攪拌自然狀態(tài)下重懸沉淀；
13. 在Dounce勻漿器中用研杵輕輕地研磨3次以完成重懸；
14. 用緩沖液補(bǔ)償?shù)皆�體積，再傾倒至新管中；
15. 重復(fù)步驟9—14 3次；
16. 最后，將純化了的重線粒體重懸于合適的介質(zhì)中（與后序分析相一致）；