器材和試劑:
1. 倒置相差顯微鏡,具有10×物鏡;
2. 標注體積刻度的試管(圓錐形底);
3. 改良的Neubauer血細胞計數器;
4. 計數器蓋玻片;
5. 袖珍管或等體積的塑料容器,如試管或離心管;
6. 巴斯德吸管(短型和長型);
7. 可調體積的微量加樣器(100—250μl);
8. 無菌槍尖;
9. 無菌刻度吸管(1—10ml)、洗耳球或自動移液裝置;
10. 10g/L臺盼藍;
11. Hanks平衡鹽溶液或儲存培養(yǎng)基;
實驗方法:
1. 準備計數器。輕輕地濕潤中央網絡區(qū)域的各個邊,用兩個拇指的壓力使蓋玻片水平地從邊緣滑動。當在中央標記區(qū)臨近的任何一邊能看見牛頓環(huán)(彩虹色)時,蓋玻片位置正確;
2. 1000r/min離心細胞懸液5min,棄上清。將細胞重懸于已知體積的培養(yǎng)基中;
3. 用巴斯德吸管來回吹打細胞懸液幾次,混勻,確定細胞均勻分散;
4. 用微量加樣器吸取250μl混勻的細胞懸液,轉入袖珍管。用一個干凈的加樣器尖吸取等體積臺盼藍溶液加入細胞懸液中。用拇指和食指快速輕彈袖珍管幾次使之混勻。立即用一個巴斯德吸管尖吸取一滴細胞懸液,輕輕地將其滴在臨近計數區(qū)的蓋玻片邊緣上。毛細作用使細胞懸液移到蓋玻片下面,填滿中央和邊緣溝之間的區(qū)域。在蓋玻片的另一邊重復該操作;
5. 將計數器放于顯微鏡載物臺上,移動載物臺直到將三條平行線界定的25個小方格的網格位于中央為止。計25個小方格內的總細胞數(染色和未染色的)(它們每一個又再分為16個更小的方格便于計數)。為了避免將同一個細胞重復計數,只數三線隔開的壓上線、左手線和中央區(qū)的細胞。如果細胞數大可用一個計數器;
6. 數完總細胞數時,在相同區(qū)域重復計數,只數藍染(死)的細胞。計算死細胞的平均數,從總細胞數中扣除死細胞數得到活細胞數;
7. 應用以下公式計算細胞群的存活率:
存活率=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%
8. 細胞懸液的細胞濃度按照一下方法計算:
1個大格(25個小格)的平均細胞數×104=細胞數/ml
9. 細胞懸液總細胞數=細胞數/ml×總體積
10. 細胞懸液總的活細胞數=總細胞數×存活率(%)