原代細(xì)胞周期測定的原理和BrdU方法
原理:
細(xì)胞周期:細(xì)胞一世代所經(jīng)歷的時間從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細(xì)胞群體的周期,故現(xiàn)采用其他方法測群體周期。
測定細(xì)胞周期的方法很多,有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計法等。
BrdU(5溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后,可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料,經(jīng)兩個細(xì)胞周期后,細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細(xì)胞周期的值。
試劑
1、儀器、用品:同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
BrdU方法
1、原代細(xì)胞生長至指數(shù)期時,向培養(yǎng)液中加入BrdU,最終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
8、鏡檢100個分裂相,計第一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計算:細(xì)胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)
附:
(1)BrdU配制:BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
(2)2×SSC配制:NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。