王蘭^{1, 2}   龍?jiān)沏?SUP>2  劉耀光²
1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省教育廳植物功能基因組與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

摘要：本文介紹了一種用于PCR的植物基因組DNA的快速制備方法。該方法只需將少量(4～6mg)植物葉片、適量(200μl) TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細(xì)胞研磨器中振動(dòng)5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡(jiǎn)單快速、成本低、擴(kuò)增效果好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于大量樣品的基因型檢測(cè)。

關(guān)鍵詞: 水稻，DNA制備，PCR

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳育種的各個(gè)領(lǐng)域，如種子純度鑒定、親緣關(guān)系的分析、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位以及轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)等。在大規(guī)模的基于PCR的基因型檢測(cè)作業(yè)中，高效快速的模板DNA制備顯得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸鈉(SDS)和氯仿從生物細(xì)胞中分離提取DNA樣品的經(jīng)典方法以來(lái),人們一直致力于對(duì)DNA抽提方法的探討，并先后報(bào)道了一些關(guān)于DNA抽提的方法（Dellaporta et al., 1983; 宣樸等，1998；汪秀峰等，2002；周淑芬等，2004）。但這些方法仍然煩瑣費(fèi)時(shí)。本研究對(duì)作為PCR模板的植物基因組DNA制備方法作了簡(jiǎn)化,只需將少量葉片、適量TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細(xì)胞研磨器中振蕩約5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡(jiǎn)單快速、成本低、擴(kuò)增效果好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于大規(guī)模的基因型檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)材料為粳稻品種臺(tái)中65（T65）及其雜種不育基因Sc的近等基因系E5，以及它們雜交組合構(gòu)建的F2群體，以及擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型Columbia。

1.2 基因組DNA制備方法
剪取（或用手摘�。┧�稻苗或成株葉片（剪成約3～5mm小段）或擬南芥葉片約4～6mg，12～15mg，或25～30mg，放入2ml離心管中（注：2ml離心管的底部較寬，利于鎢合金珠的振蕩），加入200μl TE （10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注：本TE中的EDTA濃度是常規(guī)TE的1/2）或200μl去離子水，放入一粒3mm直徑的鎢合金珠（Qiagen, Cat.69997），在多功能組織細(xì)胞研磨器（方統(tǒng)生物科技有限公司，型號(hào)MTM-60）上振動(dòng)約5min，把葉片打碎。取17μl溶液以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)模板DNA質(zhì)量，取1μl溶液用于PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR引物反應(yīng)
根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的水稻和擬南芥基因組序列設(shè)計(jì)PCR引物（表1），由英俊公司合成。Taq酶從杰順公司購(gòu)買。

表1  PCR引物序列

每個(gè)PCR反應(yīng)液（20μl）組成為：1× Buffer，0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每種引物，1μl上述DNA溶液。PCR反應(yīng)在My Cycler (BioRad)熱循環(huán)儀上進(jìn)行。用引物反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃ 20s， 55~58℃ 30s，72℃ 60s (InDel標(biāo)記的PCR用30s)；最后72℃ 2min。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳及檢測(cè)　

1.4.1 聚丙烯酰胺凝膠的制備
配制6%的聚丙烯酰胺凝膠100ml工作液:分別加5.7 g丙烯酰胺 (Acri)，0.3g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis-Acri），12g尿素，10ml 10×TBE，最后加水至100ml。灌膠前，每10ml膠液加入80μl 10%過(guò)硫酸銨，4μl四甲基乙二胺(TEMED),搖勻后迅速灌膠，膠凝固后即可點(diǎn)樣電泳，并通過(guò)銀染檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.2 銀染　
先用0.1% AgNO3染色液染色10～15min，再用顯影液（100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸鈉0.019g, 0.4mL甲醛）顯色,等條帶清晰后，直接用自來(lái)水沖洗終止顯色反應(yīng)，用凝膠成像儀（BioRad）或數(shù)碼相機(jī)拍照并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR模板DNA的快速制備
本方法是將少量植物葉片在TE溶液或去離子水中，經(jīng)鎢合金珠在離心管內(nèi)的振蕩破碎，直接獲得DNA溶液。用多功能組織細(xì)胞研磨器（MTM-60）一次可操作60個(gè)樣品。瓊脂糖凝膠電泳表明，用TE和去離子水都可獲得分子量較大的DNA片段（圖1A）。用TE制備的DNA在4℃下可保存10天以上，在冷凍下可保存半年。而用去離子水制備的DNA容易降解，保存時(shí)間較短，因此我們采用TE為主。

圖1 本方法制備的水稻和擬南芥基因組DNA。

注：A: 用TE（泳道1～5）和去離子水（泳道6～10）制備的水稻基因組DNA (4～6mg葉片/200μl)。 M為分子量標(biāo)記。B, C: 用200μl TE制備的不同濃度的水稻（B）和擬南芥（C）基因組DNA。泳道1～3為4～6mg葉片；4～6為12～15mg葉片；7～9為約25～30mg葉片。

2.2 不同量的模板DNA的PCR擴(kuò)增效果
本方法制備的基因組DNA沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化，含有各種可能抑制Taq酶活性的雜質(zhì)。因此，加入過(guò)多的粗制DNA可能會(huì)影響PCR反應(yīng)。為了找出適合于PCR反應(yīng)的DNA量，我們?cè)谝欢�量的TE（200μl）中加入不同量（4～6mg、12～15mg和25～30mg）的水稻和擬南芥葉片制備基因組DNA（圖1，B, C）。選用2對(duì)水稻的引物（PR1、PR2，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為540bp和890bp）和1對(duì)擬南芥引物（PA, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 kb），取1μl DNA在20μl的體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，對(duì)擴(kuò)增較小的DNA片段，所有模板都能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得最好的擴(kuò)增效果（圖2A）。對(duì)擴(kuò)增較大的DNA片段，只有用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得較穩(wěn)定的擴(kuò)增效果（圖2B, C）。

圖2 不同量的基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠（1％）檢測(cè)

注：A，B，C分別為用引物PR1，PR2，和PA進(jìn)行PCR。在所有反應(yīng)（20μl）含有1U Taq酶和1μl基因組DNA；泳道1～3，4～6，7～9分別為以4～6mg，12～15mg，和25～30mg葉片在200μl TE中制備的基因組DNA。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，用4～6mg（可以多至約10mg）葉片/200μl TE的比例制備基因組DNA溶液所含的雜質(zhì)濃度較低，加入1μlDNA溶液到20μl反應(yīng)體系中不會(huì)抑制Taq酶的活性。而加入1μl較高濃度的模板DNA對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用較大。由于模板DNA量較少（約1～2ng/μl），PCR循環(huán)數(shù)比用較大量的純化DNA模板（一般用20~50ng）的PCR要多些（多3～5個(gè)循環(huán)）。雖然可以將用較多葉片制備的模板DNA稀釋使用或加入較少量（<1μl）的模板DNA也能獲得好的PCR效果，但從簡(jiǎn)化操作步驟，提高工作效率考慮，確定最佳的經(jīng)驗(yàn)值對(duì)效率化的大規(guī)模樣品檢測(cè)尤為重要。由于加入的樣品葉片量有一個(gè)合適的范圍，在實(shí)際操作中，并不需要所有樣品都用天平稱取，以經(jīng)驗(yàn)?zāi)繙y(cè)估算即可。

2.3用于分子標(biāo)記的基因型分析
由于用本方法制備的基因組DNA可以PCR擴(kuò)增出較大的目的片段，對(duì)于PCR分子標(biāo)記，如微衛(wèi)星（SSR）、插入/缺失（InDel）、單核苷酸多態(tài)（SNP）等檢測(cè)較短的DNA片段（一般<200bp）應(yīng)該是可行的。我們用4對(duì)位于水稻秈粳雜種花粉不育基因Sc（Yang et al., 2008）連鎖區(qū)的InDel標(biāo)記引物（表1）對(duì)F2群體進(jìn)行的基因型分析。圖3顯示了部分結(jié)果，所有標(biāo)記的PCR擴(kuò)增效果穩(wěn)定，聚丙烯酰胺凝膠電泳的DNA條帶均清晰易辨。

圖3  用InDel分子標(biāo)記的水稻基因型檢測(cè)

注：A～D分別為用引物L(fēng)14-121，J04-91，P24-83，和P24-93的PCR。左邊起第1和第2泳道分別為親本E5和T65、其它泳道均為F2個(gè)體。