李建中，金琦蕓， Yap Swee Lee 沃特世公司，上海，中國

概要

本文應(yīng)用沃特世 (Waters®)Oasis® HLB 固相提取技術(shù)和 ACQUITY UPLC® 超高效液相色譜 /TQD 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)測(cè)定分析動(dòng)物性食品中糖皮質(zhì)類激素興奮劑。

前言

糖皮質(zhì)激素 (Glucocorticoids ) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于類固醇類化合物，具有調(diào)節(jié)糖代謝，促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)化為糖，提升血糖濃度，抗炎癥、抗過敏作用，調(diào)節(jié)水鹽代謝等作用。從體外大量攝入糖皮質(zhì)類激素會(huì)造成體內(nèi)激素比例失調(diào)，糖代謝和無機(jī)鹽代謝紊亂；長期大量使用糖皮質(zhì)類激素還會(huì)誘發(fā)或加重感染，出現(xiàn)心血管系統(tǒng)并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、傷口愈合遲緩以及出現(xiàn)消化系統(tǒng)并發(fā)癥，例如使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，抑制胃粘液分泌，降低胃腸粘膜的抵抗力，甚至造成消化道出血或穿孔。糖皮質(zhì)類激素對(duì)人體健康除了具有很多副作用外，也會(huì)影響運(yùn)動(dòng)員參加比賽時(shí)的身體狀態(tài)，違背了體育比賽公平競(jìng)爭的原則，所以此類藥物屬于國際奧委會(huì)宣布禁用合成類固醇類興奮劑。近年來在一些供運(yùn)動(dòng)動(dòng)員食用的保健類食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑及部分動(dòng)物性食品中檢出含有糖皮質(zhì)類激素類的事件屢有發(fā)生，由于誤食此類被污染的食品，使很多運(yùn)動(dòng)員出現(xiàn)不必要的陽性結(jié)果。 2008 年北京奧運(yùn)會(huì)除對(duì)參賽運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行嚴(yán)格的興奮劑檢測(cè)外，同樣要對(duì)供運(yùn)動(dòng)員食用的各類食品進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)。本文采用沃特世 HLB 固相提取凈化技術(shù)和 UPLC®/TQD 系統(tǒng)建立動(dòng)物性食品中糖皮質(zhì)類激素的快速、高通量篩查及確證技術(shù)，為此類食品的興奮劑監(jiān)測(cè)提供了全方案的技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)方法

試劑和材料

20 孔真空提取裝置，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， Oasis HLB(500 mg ， 6 cc ) ；乙腈，甲醇，甲酸，乙酸乙酯均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，無水硫酸鈉。糖皮質(zhì)類激素標(biāo)準(zhǔn)品：潑尼松，潑尼松龍，氫化可的松，可的松，甲基潑尼松，倍他米松，地塞米松，倍氯米松，氟氫可的松，純度 ≥98% 。

液相色譜條件

液相系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY UPLC
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18
2.1mm x 50mm ， 1.7 μm
柱溫： 30˚C
流速： 500 μL/min
流動(dòng)相 A ： 水
流動(dòng)相 B ： 乙腈
梯度： 時(shí)間 0 min 20% B
時(shí)間 5 min 25% B
時(shí)間 5.3 min 50% B
時(shí)間 5.5 min 60% B
時(shí)間 5.6 min 20% B
時(shí)間 6.5 min 20% B
總分析時(shí)間 6.5 min 進(jìn)樣量： 10 μL

質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY® TQD 檢測(cè)器
電離模式： ESI(-)
毛細(xì)管電壓： 2.8 kV
去溶劑氣溫度： 400˚C
去溶劑流速： 800 L /h
離子源溫度： 130˚C
數(shù)據(jù)采集： 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)
碰撞氣體： 氬氣 3.2 x 10-3 mba
調(diào)節(jié) ACQUITY TQD 使得母離子和子離子在半峰寬的分辨率為 0.7 Da 以內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM ) 、駐留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量列表參見表 1 。標(biāo)注下劃線的離子對(duì)用于定量分析。

數(shù)據(jù)采集和處理方法

沃特世公司 MassLynx™4.1 操作軟件用于數(shù)據(jù)采集， TargetLynx™ 應(yīng)用管理軟件用于數(shù)據(jù)處理。

樣品前處理

稱取 5 g 的處理均勻的豬肉樣品，依次加入 10 g 無水硫酸鈉， 20 mL 乙酸乙酯，混合均勻后均質(zhì) 1 min ，振蕩提取 10 min ，在 10000 轉(zhuǎn) /min 下離心 5 min 。上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中，再向殘?jiān)�中加�?10 mL 乙酸乙酯重復(fù)上述操作一次，合并兩次提取液，在 40 ˚C 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。濃縮后樣品用 5 mL 30% 甲醇水溶液溶解。 Oasis HLB 預(yù)先依次用 3 mL 甲醇， 6 mL 水活化。將上述提取液全部通過柱，依次用 5 mL 水， 5 mL 50% 甲醇水溶液淋洗后抽干。用 10 mL 甲醇 / 乙腈 (1:1 ) 洗脫并接收，洗脫液在 40˚C 下氮?dú)獯蹈珊�，用乙�?/ 水（ 2:8 ）溶解定容至 1 mL ，過 0.2 μm 濾膜后上機(jī)分析測(cè)定。

結(jié)果與討論

樣品前處理?xiàng)l件的確定

糖皮質(zhì)類激素屬于一類脂溶性激素，在結(jié)構(gòu)上都是環(huán)戊烷多氫菲衍生物。所以選擇采用乙酸乙酯作為提取溶劑能夠?qū)崿F(xiàn)從動(dòng)物組織中有效的提取此類藥物。由于此類化合物具有較強(qiáng)的非極性，在 HLB 柱上有較強(qiáng)的非極性保留作用，所以實(shí)驗(yàn)采用低洗脫強(qiáng)度的甲醇 / 水溶解樣品提取物轉(zhuǎn)移上 HLB 柱，依次用水和 50% 甲醇水溶液洗除極性、中等極性的樣品基質(zhì)雜質(zhì)，再用甲醇 / 乙腈混合溶劑把糖皮質(zhì)類激素藥物洗脫下來，而部分動(dòng)物油脂等非極性雜質(zhì)保留在 HLB 上，從而實(shí)現(xiàn)了糖皮質(zhì)類激素的有效凈化富集。

表 1. ACQUITY TQD MRM 參數(shù)。

色譜條件的優(yōu)化

由于 9 種糖皮質(zhì)類激素化合物極性上存在一定差異，所以采用梯度方法在乙腈 / 水的流動(dòng)相體系下實(shí)現(xiàn)分離，結(jié)果見圖 1 。其中潑尼松龍和可的松 (405.2 ﹥ 329.2 ， 405.2 ﹥ 359.2 ) ，倍他米松和地塞米松 (437.2 ﹥ 361.2 ， 437.2 ﹥ 391.2 ) 兩組化合物的母離子和子離子完全一樣，只是在結(jié)構(gòu)上空間異構(gòu)，在質(zhì)譜上無法區(qū)分，所以必須通過色譜實(shí)現(xiàn)分離后定量定性分析，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了梯度程序、色譜柱溫及流速，使兩組化合物實(shí)現(xiàn)了基線分離，從而能夠準(zhǔn)確定性和定量測(cè)定。

質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在 ESI(-) 模式下，糖皮質(zhì)類激素化合物形成 [M-H+HCOOH]- 形式的分子離子峰，通過碰撞處理，子離子掃描進(jìn)一步得到定量和輔助定性子離子碎片峰，進(jìn)而采用 MRM 模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)， MRM 條件參見表 1 。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使方法靈敏度和分辨率滿足檢測(cè)需要。

方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度

9 種糖皮質(zhì)類激素混合標(biāo)準(zhǔn)品在 1 ng/mL ~ 100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣分析，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。采用空白樣品添加 10μg/kg 水平下，平行 6 次，計(jì)算添加回收率及 RSD ， 結(jié)果參見表 2 和圖 2 。

圖 2. 糖皮質(zhì)類激素標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品、添加樣品總離子流 (TIC ) 色譜圖。

表 2. 糖皮質(zhì)類興奮劑測(cè)定方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率。

結(jié)論

本文采用 HLB 凈化和 UPLC/TQD 系統(tǒng)建立了快速有效的監(jiān)測(cè)動(dòng)物性食品中 9 種糖皮質(zhì)類激素的全分析方案。 Oasis HLB 能夠有效地對(duì)動(dòng)物性樣品進(jìn)行凈化和富集，除去油脂、蛋白等基質(zhì)干擾，提高了方法靈敏度，降低了基質(zhì)效應(yīng)； UPLC/TQD 系統(tǒng)在 6.5 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高效分離和快速測(cè)定，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量和確證的目的。為奧運(yùn)動(dòng)物性食品中糖皮質(zhì)類激素的監(jiān)測(cè)提供了有力的技術(shù)支持和參考，也對(duì)其它類型食品的監(jiān)測(cè)提供有意義的借鑒

參考文獻(xiàn)

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