（第二代高通量測序技術(shù)-454）
　　轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個重要手段。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長時期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。羅氏GS-FLX-Titanium第二代高通量測序儀平均讀長超過400bp，在測序讀長上遙遙領(lǐng)先于其它第二代高通量測序儀，使其成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的首選測序平臺，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
　　
一、 羅氏454測序技術(shù)在環(huán)境微生物生態(tài)多樣性研究中的突出優(yōu)勢體現(xiàn)在：
（1） 測序序列長，便于聚類拼接，可以對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行從頭組裝（de novo assembly）。
（2） 測序通量高，可以檢測到低豐度轉(zhuǎn)錄本信息。
（3） 可以對無基因組參考序列的新物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和亞型。
（4） 實(shí)驗(yàn)操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。無需進(jìn)行克隆的文庫構(gòu)建，雙鏈cDNA連接454接頭后可以直接進(jìn)行測序，實(shí)驗(yàn)周期短。
（5） 測序數(shù)據(jù)便于進(jìn)行生物信息分析，可以進(jìn)行基因差異表達(dá)分析、鑒定基因的可變剪切以及預(yù)測新基因。

二、 美吉公司在環(huán)境微生物生態(tài)多樣性研究中的突出優(yōu)勢體現(xiàn)在：
（1） 擁有自主實(shí)驗(yàn)室和高通量測序平臺，可以根據(jù)客戶要求靈活安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期短，取樣方便，質(zhì)量可靠。
（2） 技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)豐富，可以穩(wěn)定地進(jìn)行總RNA的提取和雙鏈cDNA的合成，可以根據(jù)顧客要求第一時間提供實(shí)驗(yàn)方案。
（3） 有專業(yè)的生物信息團(tuán)隊和大型計算機(jī)，可以為客戶提供個性化的生物信息分析服務(wù)。
（4） 開放式實(shí)驗(yàn)室，參與式服務(wù)�？蛻舨坏�可以參與整個實(shí)驗(yàn)過程，而且可以參與生物信息分析，提供最為增值的售后服務(wù)。

三、 服務(wù)流程
（1） 客戶提供樣本背景信息、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)預(yù)期。
（2） 美吉公司設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，提供測序深度建議和生物信息分析建議。
（3） 客戶認(rèn)可實(shí)驗(yàn)方案，雙方簽訂項(xiàng)目合作協(xié)議。
（4） 項(xiàng)目開始運(yùn)作，美吉公司指定專人和客戶保持無障礙溝通。
（5） 項(xiàng)目結(jié)束，美吉公司提供標(biāo)準(zhǔn)結(jié)題報告。
（6） 客戶可以和美吉公司簽訂長期合作協(xié)議，享受折扣和VIP服務(wù)。

四、 送樣要求
（1） 動物、植物、微生物組織：
> 請?zhí)峁┳懔康男迈r樣品，樣品量≥5g；植物材料應(yīng)避免過老的組織，盡量用柔嫩部位。
> 新鮮程度要求：采樣后將樣品立即液氮速凍－80℃保存（保存期不超過1個月），干冰運(yùn)輸，運(yùn)輸時間不超過72h。
> 樣本保存期間切忌反復(fù)凍融。
> 樣品質(zhì)量合格與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)：RNA提取后經(jīng)變性電泳，各RNA條帶清晰，比例適中，完整性好，無降解。
> 填寫完整的送樣訂單（請點(diǎn)擊下載），提供盡量詳細(xì)的物種基因組背景資料信息，如：基因組大小，基因平均長度，預(yù)計表達(dá)的基因數(shù)量等待。用自封袋密封后隨同樣本一起快遞。
> 樣本的送樣量和其他具體要求，請致電免費(fèi)電話400-660-1216。
（2） RNA
> 總RNA＞500ug，濃度＞1ug/ul；
> mRNA＞3ug，濃度＞50ng/ul；
> OD260/OD280為1.8-2.2；28S/18S＞1.8; RIN≥ 8（哺乳動物）
> 質(zhì)檢以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準(zhǔn)。。
> 送樣管務(wù)必標(biāo)清樣本編號，管口使用Parafilm膜密封。
> 樣本保存期間切忌反復(fù)凍融。
> 送樣時使用干冰運(yùn)輸。
> 填寫完整的送樣訂單（請點(diǎn)擊下載）和RNA電泳檢測照片，用自封袋密封后隨同樣本一起快遞。
（3） 雙鏈cDNA
> 按照美吉公司提供的cDNA 454文庫構(gòu)建流程進(jìn)行文庫構(gòu)建，去除文庫中的POLY-A。
> 總量＞5ug，濃度＞50ng/ul，OD260/280在1.8左右。
> 送樣管務(wù)必標(biāo)清樣本編號，管口使用Parafilm膜密封。
> 樣本保存期間切忌反復(fù)凍融。
> 送樣時使用干冰或冰袋運(yùn)輸。
> 填寫完整的送樣訂單（請點(diǎn)擊下載）和cDNA電泳檢測照片，用自封袋密封后隨同樣本一起快遞。

五、 無參考基因組轉(zhuǎn)錄組分析（de novo Transcriptome Analysis）
> 測序和基本數(shù)據(jù)處理
合成雙鏈Cdna      酶切去POLY-A     兩端連接454接頭     454測序     基本數(shù)據(jù)處理（圖像識別、堿基識別、過濾接頭序列）
> 生物信息分析內(nèi)容  
* 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估
* Contig長度分布
* Unigene長度分布
* Unigene 功能注釋
* Unigene GO分類
* Unigene 表達(dá)差異分析（不少于兩個樣本）
* Unigene 在樣本間的差異GO分類（不少于兩個樣本）
* Unigene 代謝通路分析
* 蛋白功能和分類預(yù)測
> 應(yīng)用領(lǐng)域
* 全基因組EST測序
* 篩選SNV、SSR和InDel分子標(biāo)記
* 基因表達(dá)譜研究
* 非編碼RNA研究

六、 有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析（Transcriptome analysis with reference genome）
> 測序和基本數(shù)據(jù)處理
合成雙鏈Cdna      酶切去POLY-A     兩端連接454接頭     454測序     基本數(shù)據(jù)處理（圖像識別、堿基識別、過濾接頭序列、檢測可能的樣本污染）
> 生物信息分析內(nèi)容
* 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量及與Reference比對結(jié)果概述
* Reads在基因組上的分布
* 測序隨機(jī)性評估
* 基因覆蓋度、測序深度的分布
* 基因差異表達(dá)分析
* 對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化
* 鑒定基因的可變剪切
* 預(yù)測新基因
> 應(yīng)用領(lǐng)域
* 基因組注釋
* 基因結(jié)構(gòu)分析（可變剪接、基因邊界等）
* 轉(zhuǎn)錄融合基因研究
* 基因表達(dá)譜研究
* 非編碼RNA研究

八、 常見問題
（1） 是否可以進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析？
> 可以。請?zhí)峁?0 ug total RNA樣品即可。
（2） 需要提供什么樣本？
> 可以提供新鮮的動物、植物、微生物組織，提取后的總RNA或合成的雙鏈cDNA均可。
（3） 實(shí)驗(yàn)周期多長？
> 美吉公司從獲得客戶樣本、高通量測序到數(shù)據(jù)分析，根據(jù)合作伙伴的個性化需求不同，一般控制在30到40個工作日內(nèi)完成。
（4） 需要多少測序量？
> 100萬條有效序列，平均讀長在300到500bp，聚類拼接后可以得到2到4萬條Unigene，Unigene的平均大小在500bp到10Kb之間。轉(zhuǎn)錄組的大小受基因數(shù)目和基因豐度雙重影響，在物種之間變化很大。此外，組織差異、狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)處理等因素也會影響轉(zhuǎn)錄組的組成。
（5） 是否可以參與實(shí)驗(yàn)和生物信息分析？
> 我們是開放式實(shí)驗(yàn)室，我們歡迎合作伙伴參與我們的實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)分析過程，在參與中增強(qiáng)溝通。
（6） 全長cDNA的判斷
> 聚類拼接后的Unigene是否為全長cDNA, 需要進(jìn)行判斷。
> 直接從序列上可以從如下幾個方面進(jìn)行判斷。
5′端:
* 有同源全長基因的比較, 通過與其它生物已有的對應(yīng)基因末端進(jìn)行Blast 來判斷。
* 無同源基因的新基因, (1)判斷編碼框架是否完整, a.在開放閱讀框架的第一個ATG 上游有同框架的終止密碼, 需要注意的是有時真正的翻譯起始密碼子并非是出現(xiàn)在mRNA 中的第一個ATG, 在有的真核細(xì)胞中, 在起始密碼子ATG 的上游非編碼區(qū)會有可能出現(xiàn)一到幾個ATG, 這稱為非編碼的5′ATG。以這種5′ATG 并不是真是的起始密碼子, 以其開始的開放閱讀框常常很快遇到終止密碼子。b.無終止密碼的則考慮有保守的Kozak序列; (2)判斷是否自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn), 有資料表明, 在5′帽結(jié)構(gòu)后一般都有一段富含嘧啶的區(qū)域, 另外如果cDNA5′序列與基因組序列中經(jīng)S1 酶切保護(hù)的部分相同, 則可以確定得到的cDNA 是全長的。
3′端:
* 有同源全長基因的比較, 方法同5′端;
* 編碼框架的下游有終止密碼;
* 有一個以上的polyA 加尾信號;
* 無明顯加尾信號的則也有polyA 尾。
> 同源全長基因的比較可以用Blast 比對或多重序列比對軟件來實(shí)現(xiàn), 首先搜索到其他物種( 以相似性比較高的物種為宜) 該基因全長cDNA 序列,再將這些序列做Blast 或多重比對。
> 確定得到的cDNA 序列為全長的cDNA 序列還只是在計算機(jī)上的“虛擬克隆”, 最終還必須通過RT-RCR、序列測定和Northern 雜交等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 以保證序列的準(zhǔn)確性。