試劑和材料:
1. 分化培養(yǎng)基:DMEM/F12(1:1)、1%ITS(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒;V/V)、TGF-β1 1ng/ml、HEPES 10mmol/L;
2. 胰蛋白酶/EDTA:胰蛋白酶(0.05%)和EDTA(0.53mmol/L)PBSA配制;
3. PBSA:無(wú)Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液;
4. 離心管,15ml;
5. 普通器皿,30ml,或圓錐底的離心管(50ml);
實(shí)驗(yàn)方法:
1. 從培養(yǎng)瓶中吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基棄之;
2. PBSA潤(rùn)洗后棄之洗液;
3. 加入足量的胰蛋白酶/EDTA覆蓋培養(yǎng)瓶底;
4. 在37℃孵育5—10min(在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落);
5. 重懸細(xì)胞,置于15ml離心管中,300g離心5min;
6. 用1ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌,轉(zhuǎn)移至普通器皿或離心管中;
7. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù);
8. 重復(fù)離心(620g,10min),棄去上清液;
9. 用分化培養(yǎng)基將其稀釋到1×106個(gè)細(xì)胞/ml;
10. 按1ml/管分裝到新Eppendorf管中;
11. 300g離心5min,上清保留不動(dòng);
12. 置于37℃孵箱;
13. 每2—3天更換培養(yǎng)基;
14. 培養(yǎng)2—3周軟骨生成;