正常小梁細胞原代培養(yǎng)
瀏覽次數(shù):1740 發(fā)布日期:2010-8-25
來源:www.pricells.com.cn
正常小梁細胞原代培養(yǎng)
實驗材料:
1. 材料來源:人眼、兔眼或者豬眼等;
2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,pH7.2;
3. 器械:小梁剪與無齒鑷等;
4. 消毒液:200IU/ml的慶大霉素生理鹽水;
5. 培養(yǎng)液:基礎液由DMEM培養(yǎng)基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO32.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。應用液是在基礎液內(nèi)補加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml,并用5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0—7.2;
6. 培養(yǎng)器皿:培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿若干;
實驗方法:
1. 將離體的供體眼球用200IU/ml的慶大霉素溶液浸泡消毒5min;
2. 無菌條件下,沿角膜緣后5mm處環(huán)形剪開眼球,剪斷晶狀體懸韌帶,去除晶狀體和玻璃體;
3. 將眼前段倒放在培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下用無齒鑷把虹膜抹離角膜內(nèi)皮面,暴露房角結構。用角膜剪緊貼虹膜與鞏膜的附著部位,剪除色素膜;
4. 以PBS溶液或平衡鹽溶液輕微沖洗小梁組織表面。用小梁剪伸入Schlemm管,楔形剪取小梁組織。前界至Schwalbe線,后界至鞏膜嵴。環(huán)形取出一塊小梁組織,置于培養(yǎng)皿中;
5. 經(jīng)PBS漂洗后將小梁組織剪碎,幾乎成漿狀;
6. 用無齒鑷挑起少許小梁組織,接種于24孔培養(yǎng)板后培養(yǎng)瓶皿中,輕輕鋪平。待組織稍干后加入適量培養(yǎng)液,在CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。第四天后開始換液,每周2次;