零殘留活性劑、零絮凝納米球在免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用
國(guó)家生化工程技術(shù)中心(北京)
1.現(xiàn)代免疫檢測(cè)的工作原理
免疫檢測(cè)是目前醫(yī)療衛(wèi)生和生物科學(xué)研究領(lǐng)域常用的診斷方法。免疫檢測(cè)的核心步驟為抗原-抗體間特異性的復(fù)合反應(yīng)，通過復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中抗體或抗原性的定量。由于抗體分子能夠識(shí)別非常有限的分子種類，因此免疫檢測(cè)能夠獲得極高的準(zhǔn)確性。
酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強(qiáng)的高效價(jià)的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。
2. 納米材料推動(dòng)免疫診斷試劑盒的開發(fā)
隨著材料科學(xué)的進(jìn)步，納米人工材料開始進(jìn)入免疫診斷試劑的開發(fā)領(lǐng)域。納米材料，特別是納米球形材料被廣泛應(yīng)用于抗體/抗原分子的負(fù)載，在眾多復(fù)合反應(yīng)過程中起到增強(qiáng)信號(hào)的作用。通過載體的放大，檢測(cè)靈敏度可提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到準(zhǔn)確的定量效果。
圖 1. 納米乳膠粒輔助的免疫檢測(cè)；A：免疫比濁反應(yīng)；B：免疫熒光檢測(cè)；C：常規(guī)和納米載體輔助的酶聯(lián)免疫顯色（HRP辣根過氧化物酶）
A：免疫比濁檢查，檢測(cè)原理如圖1A所示，免疫比濁試劑中抗體被固載于納米顆粒表面，當(dāng)抗體-抗原復(fù)合反應(yīng)發(fā)生時(shí)，會(huì)造成納米顆粒間聚集，通過分光光度計(jì)測(cè)量相應(yīng)抗原/抗體添加前后液體濁度的變化。相比傳統(tǒng)的分子間聚集，納米乳膠的團(tuán)聚體處于納米尺度，會(huì)帶來更明顯的信號(hào)相應(yīng)。
B：免疫熒光檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖1B所示，使用亞微米尺度的載體輔助初級(jí)抗體，載體粒徑為400-800nm，同樣需要將抗體固載于載體球表面，抗體抓住抗原分子后，再與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合，使載體具有穩(wěn)定的熒光信號(hào)。使用透析法洗滌納米載體，最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
C：納米球輔助的酶聯(lián)顯色反應(yīng)（ELISA），檢測(cè)原理如圖1 C所示，使用小尺度載體，載體粒徑為30-200nm，操作方法如常規(guī)ELISA操作，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。并考察納米載體的引入對(duì)檢測(cè)靈敏度的貢獻(xiàn)。相比傳統(tǒng)的復(fù)合反應(yīng)過程，納米載體能夠引入更多酶分子（辣根過氧化物酶HRP），帶來更顯著的檢測(cè)信號(hào)。
3. 適用于抗原/抗體分子負(fù)載的納米微載體
圖 2. 納米載體的電子顯微鏡照片；A：放大1E4倍300納米微載體，B：放大4E4倍160納米微載體，C：放大4E4倍410納米微載體
圖
3. 160納米載體固載蛋白前后原子力顯微鏡照片；A：空白球原子力顯微鏡高度圖，B：空白球原子力顯微鏡相位圖，C：表面覆蓋一層谷氨酸脫氫酶后相位圖 在獲得相應(yīng)抗體/抗原分子基礎(chǔ)上，納米支撐材料的性能成為開發(fā)新型免疫檢測(cè)試劑的關(guān)鍵。為滿足蛋白分子固定化的需要，國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(北京)經(jīng)過多年研究,初步建立了納米、亞微米聚合物微球的制備和純化工藝。能夠分別制備出50-800nm多種尺寸、多種表面基團(tuán)的聚合物微載體，實(shí)現(xiàn)了克級(jí)的制備規(guī)模，部分產(chǎn)品圖片如圖2所示。相比市場(chǎng)上同類產(chǎn)品，我國(guó)自主開發(fā)的產(chǎn)品真正實(shí)現(xiàn)了“表面活性劑零殘留”，在后期純化過程中首次實(shí)現(xiàn)了“零絮凝”，達(dá)到了更高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。相比文獻(xiàn)中報(bào)道的制備工藝，自主研發(fā)工藝將生產(chǎn)效率提高了3-5倍，并且更有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。在多種納米球成功制備的基礎(chǔ)上,中心的研究將多種納米載體用于蛋白分子的固載。如圖3所示，通過原子力顯微鏡表征，能夠清楚的分辨出蛋白質(zhì)分子固載前后，載體界面性能的變化。
納米載體與酶分子的結(jié)合方法如圖4所示，使用水溶性碳二亞胺（EDC）活化納米球表面的羧基，使其與蛋白表面氨基形成酰胺鍵。該交聯(lián)方法條件溫和，有利于蛋白分子的活性保持。但羧基載體難以固定等電點(diǎn)較低的蛋白分子，在反應(yīng)條件下，低等電點(diǎn)蛋白分子與載體都帶有負(fù)電荷，難以相互靠近。在羧基球的基礎(chǔ)上，通過接枝帶有伯氨基的分子，將羧基載體改性為氨基載體。用相似的方法，活化蛋白分子上的羧基，再同載體表面氨基形成酰胺鍵，或使用氨基間交聯(lián)的方式，實(shí)現(xiàn)抗體/抗原分子的固定。
圖4. 納米載體與抗體分子偶聯(lián)的示意圖；A：羧基載體的交聯(lián)途徑；B：氨基載體的交聯(lián)途徑
許多免疫制劑公司已經(jīng)開始采用納米微球來提高自己產(chǎn)品的質(zhì)量，但國(guó)外的納米微球價(jià)格昂貴，無形中大大提高了試劑盒的生產(chǎn)成本。而隨著國(guó)家對(duì)生物材料研究的重視和投入,我國(guó)自主開發(fā)的納米微球不僅成本較低，而且在質(zhì)量上實(shí)現(xiàn)了“表面活性劑零殘留”，在后期純化過程中首次實(shí)現(xiàn)了“零絮凝”，達(dá)到了更高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。相比文獻(xiàn)中報(bào)道的制備工藝，自主研發(fā)工藝將生產(chǎn)效率提高了3-5倍，并且更有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)�；a(chǎn)。如果在廣大的試劑盒生產(chǎn)廠家和公司得到廣大應(yīng)用，無疑會(huì)引發(fā)試劑盒生產(chǎn)領(lǐng)域的新革命。同時(shí)對(duì)于打破行業(yè)壟斷,提高國(guó)人對(duì)自主研發(fā)產(chǎn)業(yè)的信心,無疑也會(huì)起到積極的推動(dòng)作用。
作者：武老師
國(guó)際生化工程技術(shù)研究中心（北京）
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標(biāo)簽：
納米微球免疫診斷試劑盒
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