正常大兔腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 正常兔大腦皮質(zhì)組織；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. M199培養(yǎng)液（含20%小牛血清、肝素25U/ml、HEPES 10mmol/L、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素）；D-Hanks液；0.05%胰蛋白酶溶液；0.05%膠原酶溶液；15%右旋糖苷（用Hanks配制，pH7.4）；

4. 勻漿器、手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術(shù)器械；

5. 離心管（15ml、50ml）

6. 網(wǎng)篩：110μm尼龍網(wǎng)篩

實驗方法：

1. 通過頸動脈放血將兔處死，去頭皮。將頭顱取出并浸入75%的乙醇中，消毒約1min。在無菌狀態(tài)下迅速取出兔大腦皮質(zhì)。需小心剔除大血管和軟腦膜；

2. 將腦皮質(zhì)放入D-Hanks液中，漂洗數(shù)次后，將其剪碎。再移入含0.05%胰蛋白酶溶液的小瓶內(nèi)，在37℃水浴中消化10—20min；

3. 用有血清培養(yǎng)液中止消化。置于玻璃研磨器內(nèi)研磨，制成粗懸液。經(jīng)孔徑為110μm尼龍篩網(wǎng)過濾，將濾液以4000r/min離心10min；

4. 棄離心后的上清液。給沉淀加入15%右旋糖苷溶液，重新懸浮沉淀。然后，再以4000r/min離心20min。收集微血管片段；

5. 用0.05%膠原酶溶液消化2—4h。用Hanks液洗滌并離心，給微血管片段加入M199培養(yǎng)液；

6. 接種到培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中（濕度100%）培養(yǎng)

7. 24h后換液，將未貼壁的微血管段移入其它培養(yǎng)瓶或皿中繼續(xù)貼壁生長。之后，每3d換液一次，待細(xì)胞長至融合狀態(tài)時，即可進行傳代培養(yǎng)；