利用 UPLC 和 Xevo TQ-S 對血漿中的治療性多肽進(jìn)行高靈敏度定量分析

Robert S. Plumb 、 Gareth Booth 和 Paul D. Rainville

美國米爾福德馬薩諸塞州沃特世公司

應(yīng)用優(yōu)勢

Xevo TQ-S 是一款新型的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng) ， 可提供最高靈敏度的多肽生物分析。它具有快速的數(shù)據(jù)捕獲率和雙掃描多反應(yīng)監(jiān)測能力，可對 UPLC ® 產(chǎn)生的狹窄色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定量并可準(zhǔn)確確認(rèn)色譜峰的特性。

沃特世解決方案

Xevo™ TQ-S
ACQUITY UPLC ®
ACQUITY UPLC BEH 色譜柱化學(xué)品
MassLynx™ 與 TargetLynx™ 的聯(lián)合使用

關(guān)鍵詞

StepWave™, T-Wave,™ 多肽生物分析、去氨加壓素

簡介

多肽因其高耐受性、靶受體選擇性和高效能的特性而逐漸被作為治療藥物使用。要對生物體液中的這些治療性多肽進(jìn)行準(zhǔn)確定量，就必須具備選擇性分離技術(shù)、高分辨力色譜系統(tǒng)及高靈敏度檢測器。高分辨力的色譜系統(tǒng)可從血漿和血液中的內(nèi)源性多肽中分離出目標(biāo)分析物，其中部分可能是相同質(zhì)量數(shù)的離子或形成相同質(zhì)量數(shù)的碎片離子。由于這些治療性多肽可模仿或取代內(nèi)源性多肽的活性，檢測過程中必須對這些內(nèi)源性和外源性多肽進(jìn)行區(qū)分。

StepWave 離子傳輸技術(shù)

傳統(tǒng)離子傳輸技術(shù)

圖 -1 采用 MRM 模式對大鼠血漿提取物中的去氨加壓素進(jìn)行 UPLC/MS/MS 定量分析。上面的色譜圖表示采用 Xevo TQ-S 的新型 StepWave 離子傳輸技術(shù)的峰值響應(yīng)；下面的色譜圖表示采用傳統(tǒng)離子傳輸技術(shù)時(shí)的峰值響應(yīng)。

去氨加壓素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

盡管我們觀測到的是多電荷化合物，且多肽高分子質(zhì)量為 1000~4000 amu ，但對于這些多肽的檢測，要求質(zhì)譜儀的質(zhì)量檢測上限為 2000 m/z 才可成功對其進(jìn)行分析。在本應(yīng)用紀(jì)要中，針對高靈敏度多肽生物分析，我們介紹了 ACQUITY UPLC 系統(tǒng)和新型的高靈敏度串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng) Xevo TQ-S 的使用情況。

實(shí)驗(yàn)條件

色譜

液相色譜（ LC ）系統(tǒng)： ACQUITY UPLC （二元溶劑管理系統(tǒng)、樣品管理器、 HT 色譜柱恒溫箱）
柱條件 ： ACQUITY UPLC BEH C 18 柱 ， 1.7 微米 ， 2.1 × 50 毫米
柱溫 ： 40 °C
梯度： 乙腈（含 0.1% 甲酸），從 5% ~ 45% 洗脫 1.5 分鐘以上
流速： 450 微升 / 分鐘
進(jìn)樣量： 10 微升

質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)： Xevo TQ-S 和 Xevo TQ 于電噴霧正離子模式下操作
MRM 數(shù)據(jù)采集 535 => 328
電壓 ： 對質(zhì)譜儀的錐孔氣流及毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞電壓都進(jìn)行了最佳優(yōu)化
源溫度： 140 °C
脫溶劑溫度： 625 °C
噴霧氣體流量： 1200 升 / 小時(shí)

數(shù)據(jù)管理

MassLynx 4.1
TargetLynx 應(yīng)用管理系統(tǒng)

結(jié)果和討論

多肽治療藥物具有極好的療效，但同時(shí)也通過新陳代謝或以原型藥物迅速排出體外。為準(zhǔn)確測定這些藥物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ PK ），就必須擁有高靈敏度的 LC/MS/MS 系統(tǒng)來確定后期時(shí)間點(diǎn)，從而確定 PK 曲線的消除相。 Xevo TQ-S 是一種具備創(chuàng)新源設(shè)計(jì)的新型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀。這種新的設(shè)計(jì)允許更多的分析物離子遷移至分析器，從而大大提高了離子抽樣過程的效率。它是通過使用更大的抽樣孔和差分抽氣區(qū)以及離軸多層環(huán)離子傳輸技術(shù)，以阻止中性化合物進(jìn)入儀器的分析區(qū)。

為評估在生物體液中進(jìn)行多肽分析時(shí)的靈敏度增加情況，將去氨加壓素注入血漿并通過乙腈沉淀蛋白質(zhì)（ 2:1 ）萃取。采用傳統(tǒng)光學(xué)技術(shù)和新的 StepWave 光學(xué)技術(shù)所獲取的數(shù)據(jù)如圖 -1 所示。在這里我們可以看到：在采用傳統(tǒng)離子傳輸技術(shù)的儀器中幾乎看不到去氨加壓素的色譜峰，而在 Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀中則可看到明顯的色譜峰。將傳統(tǒng)源的基線擴(kuò)展，比較圖 -2 中的數(shù)據(jù)，我們可以清楚地看到傳統(tǒng)儀器色譜中在 0.73 分鐘時(shí)有一個(gè)去氨加壓素的色譜峰。以此測得靈敏度增加到原來的 25 倍。

StepWave 離子傳輸技術(shù)

傳統(tǒng)離子傳輸技術(shù)

圖 -2 采用 MRM 模式對大鼠血漿提取物中的去氨加壓素進(jìn)行 UPLC/MS/MS 定量分析。上面的色譜圖表示采用 Xevo TQ-S 的新型 StepWave 離子傳輸 技術(shù)的峰值響應(yīng)；下面的色譜圖表示采用傳統(tǒng)離子傳輸技術(shù)時(shí)的峰值響應(yīng)（將基線擴(kuò)展以顯示 0.74 分時(shí)的去氨加壓素色譜峰）。

結(jié)論

多肽治療藥物可用于治療新的疾病，且副作用、藥物與藥物之間的相互作用及毒性均較小。 Xevo TQ-S 與 ACQUITY UPLC 的聯(lián)合使用 ， 為分析生物體液中的多肽提供了理想的平臺(tái)。二者的聯(lián)用可提供：

* 最高的靈敏度
* 快速的分析
* 內(nèi)源性多肽分辨率
* 分析器中充足的質(zhì)量范圍，以對大分子多肽進(jìn)行定量分析