主要應用:
應用實時熒光PCR技術進行快速準確的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容之一，它可以在轉錄水平抑制基因的表達。具體的過程是在胞嘧啶－鳥嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一個額外的甲基團，形成5－甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度較高的區(qū)域在人體基因組中呈非隨機分布于，優(yōu)先分布于基因的啟動子區(qū)，并被稱為CpG島[1]。對于癌癥，其基因組的甲基化分布發(fā)生變化[2]。正常狀態(tài)下應甲基化的區(qū)域未甲基化，而癥狀狀態(tài)下非甲基化區(qū)域出現(xiàn)甲基化，例如CpG島相關啟動子呈超甲基化。這可導致受累基因座的染色質(zhì)結構發(fā)生變化，致使基因沉默。啟動子超甲基化可導致有關腫瘤演進的重要基因再次沉默，例如那些有關DNA修復、細胞周期調(diào)控和凋亡的基因。因此，可以認為DNA甲基化與腫瘤研究密切相關。腫瘤中某些基因的DNA甲基化狀態(tài)的變化通過其生物學特征反映出來。因此，評估DNA甲基化的快速高通量方法對研究者和臨床醫(yī)生在診斷、治療和預后都非常有實用價值[3].
當前對于DNA甲基化研究，普遍使用的方法有甲基化特異性PCR，變性高效液相色譜法（DHPLC），聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA）等，這些方法各有優(yōu)勢，但是均存在諸如實驗設計復雜，易產(chǎn)生假陰性或假陽性等問題，提示科學家尋找更加容易且準確的分析手段。
甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）是近年興起的一種適用于評估特定基因DNA甲基化的新技術[4]。它基于當前實時熒光PCR儀器的前沿應用 – 高分辨率熔解曲線分析（HRM），使用既可擴增甲基化序列也可擴增非甲基化序列的引物對來自經(jīng)重亞硫酸鹽修飾的DNA的相關區(qū)進行PCR擴增。重亞硫酸鹽修飾DNA，讓非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不變，隨后通過PCR擴增檢測感興趣區(qū)域的甲基化狀態(tài)。在MS-HRM中，在飽和的DNA結合染料存在的情況下進行PCR反應，在擴增后進行高分辨熔解曲線分析，HRM分析的特點為可以區(qū)分擴增產(chǎn)物中少至1個堿基變化的序列差異，從而通過尿嘧啶/胞嘧啶的差異判斷擴增子來源于甲基化還是非甲基化的初始模板變異體。MS-HRM可評估引物之間整條擴增子的甲基化狀態(tài)。由于它是一種閉管方法，可初步快速評估甲基化。相比于傳統(tǒng)的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量靈活（最多一次篩查384個樣本，最少幾個樣本），并且準確率大大提升。結合標準品的特征熔解曲線，還可以對樣本中存在的甲基化DNA比率進行基本的定量。
更多有關特定CpG位點的甲基化的詳細信息，可采用重亞硫酸氫鹽修飾后測序分析。
我們使用羅氏診斷公司的LightCycler®480高分辨熔解擴增試劑盒在LightCycler®480實時熒光PCR儀上，通過MS-HRM測定法對兩種已知的經(jīng)過啟動子（FANCE和MGMT）甲基化的DNA修復基因的檢測性能。
材料和方法
將多種細胞株的DNA樣本作為檢測模板。每μg的每種DNA樣本都經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾。通過在正常DNA（經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾）池中按50％、25％、10%、5％和1％稀釋100％的甲基化對照DNA（經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾）以創(chuàng)建甲基化標準品。MS-HRM引物按Wojdacz和Hansen描述的方法設計[5]。使用LightCycler®480高分辨熔解擴增試劑盒在96孔LightCycler®480儀器中執(zhí)行擴增和熔解反應。

圖1：（a）含100％甲基化和非甲基化質(zhì)控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標準品的FANCE MS-HRM測定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數(shù)據(jù)。（b）含100％甲基化和非甲基化質(zhì)控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標準品的MGMT MS-HRM測定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數(shù)據(jù)。