一、簡述
近代質(zhì)粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表，鑒于大局桿菌（E.coli）在分子生物學(xué)研究中的重要地位，從E.coli中分離純化質(zhì)控DNA〈Piasmid DNA〉成為近年來超離心技術(shù)中一個重要課題。而質(zhì)粒DNA的快速分離純化又對超離心設(shè)備（超速離心機(jī)、轉(zhuǎn)頭和附屬設(shè)備）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核細(xì)胞生物，由于原核細(xì)胞缺乏其核細(xì)胞所具有的那種由單位膜組成的可把多種功能組分分隔為專一化的和局部獨(dú)立區(qū)域的內(nèi)膜系統(tǒng)，因而沒有其核細(xì)胞所包含的細(xì)胞器（核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線拉體、溶酶體等等）。電鏡顯微照片顯示E.coli有兩個可以區(qū)別的內(nèi)部區(qū)域一一細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)，在它們外面圍著一層較薄的細(xì)胞質(zhì)膜和很厚的細(xì)胞壁，在細(xì)胞壁外部附著一些一端游離的鞭毛。質(zhì)粒DNA位于核區(qū)，以細(xì)絲狀存在，這種細(xì)絲狀物在多種情況下是極長的環(huán)狀DNA的一些片斷所折疊起來的聚密體。
針對E.coli的顯微結(jié)構(gòu)待點(diǎn)，在進(jìn)行超離心分離純化質(zhì)粒DNA之前的預(yù)處理順序是：
E.coli→用溶菌酶去細(xì)胞壁→用表面活性劑如SDS、Triton X-100等破細(xì)胞膜→用乙酸鈉使DNA、RNA及蛋白質(zhì)大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE緩沖液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子篩上柱去蛋白,去RNA;也可以用超速離心法去蛋白質(zhì),去RNA，去級狀DNA或DNA斷片。本文將綜述后一種方法在近年來的新進(jìn)展.

二、質(zhì)粒DNA超速離心分離的最新進(jìn)展
1、 傳統(tǒng)的分離方法：數(shù)年前，由于受設(shè)備條件限制，質(zhì)粒DNA的分離一般用CsCl平衡等密度離心法，自形成梯度。以10~12ml單管容量為例，用甩平轉(zhuǎn)頭分離，36.000rpm×60小時，用角式轉(zhuǎn)頭分離45,OOOrpm×36小時，前者包括加減速在內(nèi)共用去1.3億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命，后者也要用去1億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命，這對當(dāng)時超速離心機(jī)總壽命為100~200億轉(zhuǎn)來看，無疑每次實(shí)驗(yàn)費(fèi)用過高，加上CsCl用量多、價格貴等因素，使這類分離純化工作成為非常昂貴的實(shí)驗(yàn)。
2、新進(jìn)展：
（1）超速垂直管轉(zhuǎn)頭的離心分離（欽合金或碳纖維制造的）：從1975年垂直管轉(zhuǎn)頭向世后，近年來各主要離心機(jī)生產(chǎn)商開發(fā)的垂直管轉(zhuǎn)頭，單管容量0.2ml到4Oml，最高轉(zhuǎn)速從50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可達(dá) 700,000×g，90年代開發(fā)的新機(jī)型和轉(zhuǎn)頭己能夠使質(zhì)粒DNA垂直管離心分離實(shí)驗(yàn)做起來得心應(yīng)手。
使用垂直管轉(zhuǎn)頭分離純化質(zhì)粒DNA的待點(diǎn)是：.
·由于沉降距離最短，離心時間最短，高效、低耗：
·離心管縱向剖面積遠(yuǎn)大子橫向截面積，離心沉降時純祥品區(qū)帶的容量較大，在沒有沉淀附著或沉淀附著很緊很密的條件下分離純度高，樣品加載量也較大；流體靜壓力,不會因靜壓過高而使生物體顆粒受到損傷.離心管內(nèi)樣品顆粒受到的流體靜壓為：

式中：ω：角速度
r：樣品顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)中心距離（以厘米計）
r₁:轉(zhuǎn)頭最小離心半徑即r_min（厘米），在使用g_max離心時是液面和旋轉(zhuǎn)中心的距離。
P_a:起始密度（對預(yù)形成梯度時為最小密度,對自形成梯度離心,為離心結(jié)束時最小密度）。
a：梯度斜率
在超速離心中，P值相當(dāng)大，一般認(rèn)為P≤1500kg/cm²,才不致?lián)p傷生物體顆粒，垂直管轉(zhuǎn)頭（r-r₁）很小,相對說P也相當(dāng)小（102數(shù)量級），而對甩平轉(zhuǎn)頭，在離心前往往要進(jìn)行P值校核，過大時，應(yīng)降低轉(zhuǎn)速。在用垂直管進(jìn)行質(zhì)粒DNA分離純化時，RNA沉淀附在離心管壁部，在減速、梯度方向轉(zhuǎn)換時,質(zhì)粒DNA區(qū)帶從沉淀區(qū)"擦"過，使DNA中混入少量RNA而影響純度。
在極高轉(zhuǎn)速離心時（如大于80,000rpm），由于RNA附著壁部較緊,這種影響較小。
(2)近垂直管轉(zhuǎn)頭離心分離：為了消除垂直管轉(zhuǎn)頭用于質(zhì)粒DNA離心在壁部形成的RNA沉淀對已形成的DNA區(qū)帶的污染，同時也為了改進(jìn)一般斜角式轉(zhuǎn)頭（傾角25·~35·）由于沉降距離較長，因而分離時間也較長的缺點(diǎn)，近幾年開發(fā)了多種近垂直管轉(zhuǎn)頭（即Near VerticalTube Rot時,簡稱NVT轉(zhuǎn)頭或Neo Angle Rotor,小假角轉(zhuǎn)頭,簡稱NT).它們的離心管縱剖面中心軸線與離心機(jī)驅(qū)動軸線之間夾角在7.5·~10·之間,轉(zhuǎn)速從65,000rpm到120,000rpm，RCFmax可達(dá)646,000×g單管容量從2ml至13.5ml。NVT（或NT）轉(zhuǎn)頭的開發(fā)主要是為質(zhì)粒DNA分離而設(shè)計，當(dāng)然它也適用于線粒體DNA、染色體DNA、RNA及血清脂蛋白的分離·純化。
使用NVT（NT）轉(zhuǎn)頭分離純化質(zhì)粒DNA的特點(diǎn)是:
離心所需時間比垂直管轉(zhuǎn)頭稍長（增加30%~40%），但比一般斜角式轉(zhuǎn)頭短（為同類斜角式轉(zhuǎn)頭分離時間的60%~70%）。
雖然因?yàn)閮A角小而使RNA版離心管外壁下滑分力較小，但在加入表面活性劑(如0.1%~0.001%Triton X-100）后，RNA沉淀可以較快地滑向離心管底部（即在自形成梯度時,RNA已到達(dá)底部），在梯度轉(zhuǎn)換過程中不影響質(zhì)粒DNA純度；
流體靜壓小，極高速運(yùn)轉(zhuǎn)時也不會損傷生物體顆粒；
離心管縱剖面比一般角式及甩平轉(zhuǎn)頭部大，分離純度高，樣品加入量較大。
（3）不連續(xù)階梯梯度分離:質(zhì)粒DNA分離純化傳統(tǒng)方法是采用全管CsCl自形成梯度平衡等密度離心法，離心開始時全管CsCl密度均一，樣品均勻分布其中。
CsCl自形成梯度的離心時間可以用下式計算：

式中N：實(shí)際轉(zhuǎn)速(rpm)
P:樣品（如質(zhì)粒DNA）在CsCl的浮動密度
r:從旋轉(zhuǎn)中心到純樣品帶中心的距離（厘米），作為初步結(jié)算，對質(zhì)粒DNA離心，r位置可定在離心管中部，r平均刊點(diǎn)再偏外-10%。（rmax-rmin）。
F:取決于梯度材料及溶液初始密度的常系數(shù)〈表1〉。
S_20.w：樣品（質(zhì)粒DNA）在20℃水中沉降系數(shù)，可參照有關(guān)文獻(xiàn)決定。

[注]表中TCA為三氯乙酸,TFA為三氟乙酸
用以上公式算出的離心時間和實(shí)際離心結(jié)果非常接近。從公式可以看出T反比子（N⁴、r²），顯然在CsCl不結(jié)晶析出的前提下提高（N⁴、r²）將會減少離心時間,而增加轉(zhuǎn)速的效果特別明顯。但是對于某些較低轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭（如 65,000rpm以下）CsCl自形成梯度所需時間過長（10小時）以上，因此質(zhì)粒DNA純樣品區(qū)帶形成的時間也比較長.
作為對全管初始等密度條件的改進(jìn)，近幾年發(fā)展了階梯形不連續(xù)CsCl梯度的平衡等密度離心，即離心管初始梯度分二部分：
下部：高密度區(qū)（ρ=1.80-1.81g/cm³），占總?cè)萘?/3。
上部：低密度區(qū)（ρ=1.46-1.48g/cm³），占總?cè)萘?/3，實(shí)驗(yàn)證明，二階不連續(xù)CsCl梯度可比全管等密度離心所需時間要短得多（以12ml垂直管轉(zhuǎn)頭為例，質(zhì)粒DNA，CsCl梯度55,000rpm，20℃；不連續(xù)二階梯度離心為5.5 小時,全管等密度離心為8小時）。
二階不連續(xù)梯度離心，樣品加在靠離心管底部的高密度區(qū)，無論對何種轉(zhuǎn)頭，其r很大；而且只存在樣品的上浮而不存在低密度區(qū)（低離心加速度區(qū)）樣品的沉降；在接近DNA浮動 密度區(qū)初始密度差較大,自形成梯度，時間較短；由于以上原因縮短了離心時間。（4）超高速多級（轉(zhuǎn)速）分離：很明顯，根據(jù)T公式提高轉(zhuǎn)速將會加速CsCl梯度的形成，離心時間也會相應(yīng)縮短。但是，在某溫度下的高轉(zhuǎn)速，長時間離心分離對于較高密度的CsCl來說很可能產(chǎn)生局部結(jié)晶析出，而局部結(jié)品析出不僅會影響梯度，而且會因析出的固態(tài)CsCl因損傷離心管壁而造成離心失敗或事故.為此,對于質(zhì)粒DNA離心分離實(shí)驗(yàn)，由于新型超速機(jī)的可編程序運(yùn)轉(zhuǎn)的特點(diǎn)�？梢詮臉O高轉(zhuǎn)速逐漸向稍低轉(zhuǎn)速推移，每次實(shí)驗(yàn)分成很多轉(zhuǎn)速擋，既提高了效率，又保證了實(shí)驗(yàn)成功和安全。
當(dāng)然，這類實(shí)驗(yàn)是要經(jīng)過多次摸索，才能形成常用的離心程序，美國Beckman公司和日本Hitachi koki株式會社都在各自的先進(jìn)的超速機(jī)上做了大量實(shí)驗(yàn)，并向用戶推薦可靠、高效的離心理序[2、3]。

三、典型的質(zhì)粒DXA超速離心分離舉例

1.傳統(tǒng)分離舉例：
例（1）單管容量為12ml，最高轉(zhuǎn)速在50,000rpm以下的角式轉(zhuǎn)頭，12PA密封管，各廠新型超速機(jī)。
樣品+TE液（配成pH8.0），EB加入量0.2mg/ml，加入CsCl配成全管ρ=1.57g/ml45,000rpm×36小時，20℃，慢減速或55,000rprn×16小時+40,000rpm×1小時，20度慢減速。
分離結(jié)果:管中部稍下形成純質(zhì)粒DNA帶，中部稍上出現(xiàn)DNA片斷帶，近底部為RNA沉淀，上浮物為蛋白質(zhì)。
特點(diǎn)：分離結(jié)果較好，但純樣品帶較寬，分離時間很長，用去近1億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命。
例（2）單管容量為5ml，最高轉(zhuǎn)速為65,000rpm的鐵吊椅甩平轉(zhuǎn)頭，5PA管，樣品配置同例（1）
特點(diǎn)：同例（5） （用去0.2億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命）。
36,000rpm×55小時,20℃,或32,000rpm×70小時,20℃。
·分離結(jié)果及特點(diǎn)：分離結(jié)果很理想，質(zhì)粒DNA帶很窄，RNA沉降于離心管球底。但離心時間過長，成本較高（用去1.1億~1.3億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命）。
2.垂直管轉(zhuǎn)頭離心分離：
例（3）日本日立cp100α主機(jī)，P100VT轉(zhuǎn)頭（700,000×g,8×5ml），5PA密封管，樣品及梯度配置同例(1)
100,000rpm×1小時50分,20℃,慢減速(7檔)。
·特點(diǎn):離心結(jié)果與例(1)相似,由于轉(zhuǎn)速極高，壁部RNA沉淀很緊，在降速過程中對DNA污染很少。離心時間很短，高效，低成本(用去0.12億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命)。
例(4)最高轉(zhuǎn)速為50,000rpm的鈦垂直管轉(zhuǎn)頭，容量8×40ml，40PA密封管，樣品配置如例（1） 50,000rpm×24小時，20℃，慢減速。
特點(diǎn)：大容量分離，RNA沉淀對DNA帶稍有污染。
3.近垂直管轉(zhuǎn)頭分離
例（5）Beckman1NVT90轉(zhuǎn)頭XL-90主機(jī)，8×5ml，5PA密封管，轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速90,000rpm，646,000×g。
樣品+TE液（配成pH8.0），E·B加入量為0.2mg/ml，Triton X-100加入量為0.01%，加入Cscl配成p=1.55g/ml。78,000rpm×4小時，20℃，慢減速。
特點(diǎn)：由于Triton X-100的作用，RNA沉淀加速滑向離心管底，轉(zhuǎn)頭減速過程中對DNA沒有污染，分離結(jié)果很理想（用去0.2億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命）。
例（6）日本日立CS120EX或美Beckman TLX微量超速機(jī)，最高轉(zhuǎn)速為120,000rpm的NVT（NT）轉(zhuǎn)頭，8×2ml，2PA密封管，樣品及梯度液配置基本同例（5），但CsCL配成p=1.55g/ml,120,000rpm×3小時，20℃，慢減速。
特點(diǎn)：同例（5）（用去0.2億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命）
4.不連續(xù)階梯梯度分離：
例（7）日本日立SRP83VT轉(zhuǎn)頭，80,000rprm，549,000g，8×5時，5PA密封管（日立CPα，β系列機(jī)或SC夏系列機(jī)），梯度液配置：
先配置TE液+Cscl，ρ=1.47g/ml共3.5ml，先注入5PA密封管。
再配置TE液+樣品+CsCl配成ρ=1.81g/ml， E.B.0.2mg/ml，共1.5ml用注射器伸入管底緩緩注入使原先的p=1.47液上浮。
83,000rpm×1小時，20℃，慢加速，慢減速，結(jié)果同例(3)。
特點(diǎn)：由于使用了二階不連續(xù)梯度,CsCl自形成梯度時間縮短。超高轉(zhuǎn)速，RNA沉淀很緊，對DNA帶污染很小，高效，低成本（只用去0.05億轉(zhuǎn)驅(qū)動部壽命）。缺點(diǎn)是樣品加入量稍小。
例（8）日本日立RP55VF：轉(zhuǎn)頭，55,000rpm，293,000×g，12×5ml，樣品及梯度液配置同例（7） 55,000rpm×4.5小時，20度，慢加、減速。結(jié)果與例（7）相似。
5.超高速多級（轉(zhuǎn)速）分離：
例（9）：BeckmanXL-90超速機(jī)，NVT-90轉(zhuǎn)頭90,000rpm，645,000×g，8×5ml，5.1PA密封管，樣品及梯度液配置同例（5）。
多級分離：90,000rpm×l.5小時+87,000rpm×0.25小時+83,000rpm×0.25小時+81,000rpm×0.50小時+80,000rpm×0.50小時，20℃，慢減速。
（以上實(shí)驗(yàn)亦可在日本日立CP100α或90α主機(jī)上做用P100VT轉(zhuǎn)頭，結(jié)果相同）。
特點(diǎn)：結(jié)果同例(5)，但時間降為3小時（0.16億轉(zhuǎn)）
例（10）Hitachi微量超速CS-120EX或CS-100EX微量超速機(jī)，S100AT5角式轉(zhuǎn)頭，100,000rpm，550,000×g，8×5ml，樣品及梯度液配置與例(3)基本同，但樣品+TE液配成ρ= 1.55g/ml
100,000rpm×4.5小時+98,000rpm×15分+96.000rpm×30分+94,000rpm×30分+90,000rpm×25分+85.000rpm×30分
（共7小時），20℃，慢減速。
特點(diǎn)：使用角式轉(zhuǎn)頭，微量超速機(jī)，在離心力較小的條件下（與大型超速機(jī)相比），離心時間較短，RNA沉向管底，分離結(jié)果很理想。

四、質(zhì)粒DNA超速離心分離注意事項(xiàng)

1.防止污染 防止脫氫酶污染：脫氫酶能使DNA降解或變性，而它又無處不在（皮膚上，沒清洗并沒消毒的器具表面……），所以，在質(zhì)粒DNA分離實(shí)驗(yàn)的每一個環(huán)節(jié)都要注意這一點(diǎn)．有效的辦法是器具（離心管、蓋、注射器、移液器、盛器等等）的消毒（蒸氣消毒或0.1%焦碳酸二乙酯消毒）。雖然，我們可以加DFP（二異丙基確酸氟）或PMSF（苯甲基磷酸氟）來抑制脫氫酶的降解使用,但主要手段還是清洗和消毒。
為防止皮膚上核糖體污染，操作時應(yīng)戴上手術(shù)用手套。
2.防止重金屬鹽中存在的重金屬離子和DNA結(jié)合成復(fù)合物：CsCl為電離介質(zhì)，在離心前CsCl應(yīng)過柱以消除Cs離子，對接觸樣品的器皿也要清洗，并用去離子水沖洗。
3.樣品的加載量 樣品加入量與樣品濃度有關(guān)，為了提高分辨率，樣品加入量應(yīng)加以控制，合適的加入量應(yīng)以前人實(shí)驗(yàn)作參考。自行試驗(yàn)時，每毫升梯度液樣品量約為10μg~20μg。
4.對于角式、垂直、近垂直轉(zhuǎn)頭的自形成梯度平衡等密度分離，可用0~100Orpm快加速及1,000rprn~0慢減速，階梯梯度則要求慢加速，慢減速，近代起這機(jī)都提供了很好的范例，供用戶選擇加、減速速率時參考。
5.轉(zhuǎn)頭在離心開始時溫度應(yīng)和離心運(yùn)轉(zhuǎn)時工作溫度基本一致（土5℃），轉(zhuǎn)頭預(yù)冷溫度過低（10℃以下）在極高轉(zhuǎn)速，短時間離心時，可能因來不及升溫而出現(xiàn)CsCl析出，使實(shí)驗(yàn)失敗或發(fā)生事故。
6.合適的取樣方法：質(zhì)粒DNA超速離心分離加樣較簡易，離心后取樣方法和操作水平將決定回收率和樣品純度。首先，取樣環(huán)境應(yīng)和離心工作溫度相近（士5℃）；取樣時實(shí)驗(yàn)臺上應(yīng)無振動源；根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件相應(yīng)選擇橫向穿刺、底部空孔、離心管切割或用梯度儀收集。但無論哪一種方法部必須小心行事。
7.合適的pH值，核酸類佯品在實(shí)驗(yàn)全過程中都應(yīng)保持在pH8.0的TE液中，pH值過高過低也會使DNA變性。
8.離心管及加液量：由于近代質(zhì)位DNA的超速離心分離使用了非常高的轉(zhuǎn)速，對離心管材質(zhì)要求也很高，一般做這類實(shí)驗(yàn)的離心管只用一次。最好是用密封管，而且一段以選擇PA管為好。離心管存放期不超過2~3年，使用密封管或有蓋薄壁管樣品要加滿。使用甩平轉(zhuǎn)頭液面距管口2~3毫米以防止彎月面溢液或管口翻卷。

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn