方案一  連續(xù)蔗糖梯度：日立CPMX或WX系列離心機(jī)，P40ST轉(zhuǎn)頭13PET管或13PA管。
單管配置：
1）13PET管：20%-50%（W/W）連續(xù)蔗糖梯度。
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.5ml，從離心管低部逐層向上鋪設(shè)（底部高密度），鋪二管，直立在試管架上室溫過夜，第二天早晨放入冰箱僅5℃預(yù)冷2小時。在蔗糖液上部加樣品（約2ml）至距管口3mm。對稱放入P40ST轉(zhuǎn)頭吊桶（轉(zhuǎn)頭及吊桶在冰柜中預(yù)冷過夜）對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
2）13PA管：20%-50%（W/W）連續(xù)蔗糖梯度
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.2ml，從離心管低部逐層向上鋪設(shè)（低部高密度），鋪二管，直立在試管架上室溫過夜，第二天早晨放入冰箱5℃預(yù)冷2小時。在蔗糖液上部加樣品（約2ml）至距管口3mm。對稱放入P40ST轉(zhuǎn)頭吊桶（轉(zhuǎn)頭及吊桶在冰柜中預(yù)冷過夜）對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
結(jié)果：冠狀病毒應(yīng)沉降在蔗糖36%-40%之間（注意：空吊桶必須都按編號掛在轉(zhuǎn)頭上）

方案二 蔗糖階梯梯度
單管配置：用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度，離心管下部為45%（W/W）（PET管為4ml，PA管為3ml），上部為32%（W/W）（PET管為4ml，PA管為3ml），表面加樣品至距管口3mm（約為4.5ml）。對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
結(jié)果：病毒沉降在二個蔗糖梯度之間。

方案三  Percoll自形成梯度：日立P28ST轉(zhuǎn)頭（6X40ml）
單管配置：Percoll原液6.5ml，0.25M蔗糖23ml加樣品6ml，充分混合后注入40PA離心管至距管口3mm冰箱中預(yù)冷2小時后制備二管放入吊桶掛在P28ST轉(zhuǎn)頭上（其余4個空吊桶也要掛上），20,000rpm，1小時，5℃ 加速8，減速8。
結(jié)果：病毒沉降在Percoll 1.06密度處。
梯度取出：1）手工取出：離心管傾斜小角度后用定量吸管吸出，13ml PET離心管分別收集26管（每管0.5ml），PA管分別收集21管（每管0.5ml），各管分別測OD給出OD→離心管管容量曲線,可以看到病毒峰,確定離心管編號后即可移出,蔗糖可通過透析除去.2)儀器收集:用日立 DGF-U梯度形成一收集儀,每次做一個管子,DGF-U后出口接流動池的分光光度計(jì)，連續(xù)測OD并繪出曲線后分部收集,根據(jù)病毒峰的位置,可以確定病毒集中在哪些離心管中,透析后得到較純病毒液.

方案四 用凍融法制備的Nycodenz分離冠狀病毒
單管配置 25% Nycondenz（密度1.127g/ml）8ml注入日立13PA離心管，在-20℃冰箱中凍結(jié)，全部凍結(jié)后室溫中溶化即成為（從液面到管底）密度從1.08g/ml到1.30g/ml的連續(xù)梯度，從1.08-1.16g/ml為凸指數(shù)曲線，從1.16-1.30g/ml為凹指數(shù)曲線。
     在已溶化的連續(xù)梯度上加入樣品至距管口3mm（PA管約為2.5ml，PET管約為4ml）
日立P40ST轉(zhuǎn)頭，6x13mlTi吊桶，40,000rpm（284,000xg）12小時，加速8，減速7，20℃
離心后用DGF-U自動收集或人工收集成30管（每管0.3ml左右）在Nycodenz密度1.18g/ml處有病毒峰（離心管中段）。將30管分別測OD并繪制OD→管數(shù)曲線可找到病毒所在管。
對稱管可用30%（W/W）蔗糖配置（密度在20℃時，1.127g/ml）

作者：余興明   電話：13764301893,[email protected]