質(zhì)粒DNA分離方法比較（以E.Coli為例）
|
|
|
|
|
發(fā)酵后的E.Coli培養(yǎng)液 |
 |
|
用低速大容量冷凍離心機，大容量甩平或角式轉(zhuǎn)頭（3000~6000rpm,30~15min）或高速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭（10000～18000rpm，流量300～600ml/min） |
|
|
|
E.Coli菌體沉淀 |
|
|
|
用溶菌酶破細胞壁 |
|
|
|
用表面活性劑破細胞膜（如Triton X-100，SDS等） |
|
|
|
大部分染色體DNA粘附在膜蛋白上，用一定濃度的鹽溶液（如1 mol NaCl 或1 mol 醋酸鈉）溶解后臺式高速離心機（Eppendorf管10000rpm，10min）或高速冷凍離心機10000～12000rpm×10min，上清中大部分為染色體DNA，沉淀中含質(zhì)粒DNA，降解的質(zhì)粒DNA，RNA及蛋白質(zhì) |
|
| ||
|
在沉淀中加入異丙醇得到粗制的質(zhì)粒DNA |
沉淀中加入TE緩沖液(pH8.0) | |
|
|
| |
|
粗制DNA在-20℃在重力狀態(tài)喜愛沉淀15min以上，高速離心機12000rpm（近15000g）4℃離心5min去上清 |
用苯酚抽提去蛋白質(zhì)或用分子篩去蛋白質(zhì)
| |
|
|
用RNA酶降解RNA | |
|
真空中抽去異丙醇，溶液中加入TE緩沖液 |
| |
|
|
過柱（聚丙烯酰胺）RNA留柱，質(zhì)粒DNA過柱 | |
|
加入E.B及Triton X-100,在CsCl中（預制梯度或平衡等密度離心，自形成梯度）用角轉(zhuǎn)頭，近垂直轉(zhuǎn)頭做超速離心（見文獻10） |
| |
|
|
較純的質(zhì)粒DNA，但含有5～10%的染色體DNA和降解的DNA片段 | |
|
剩余的蛋白質(zhì)上浮，RNA沉淀，染色體DNA在離心管中上部形成區(qū)帶，質(zhì)粒DNA在離心管中下部形成純樣品區(qū)帶 |
||
|
|
||
|
密度梯度儀或其他簡易方法從離心管中抽出，經(jīng)過帶流動池的分光光度計后分部收集，從吸光度峰可以判斷質(zhì)粒DNA所在的位置 |
||
|
|
||
|
去CsCl，去其他組分得到高純度質(zhì)粒DNA |
||
標簽：
離心 質(zhì)粒 分離
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com