一、概論
在密度梯度離心中，單一樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達到的。梯度液的密度隨著離心半徑的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在離心過程中自形成，密度梯度可以分為：速率—區(qū)帶（Rate-Zonal）離心和等密度（Isopycnic）離心。
在速率—區(qū)帶離心中混合樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份“顆�！痹谔荻纫褐谐两邓俾实牟顒e，而在離心的某一時刻形成了數(shù)個含有單一組份顆粒的“區(qū)帶”。離心過程中在最“重”的樣品（或者說沉降得最快的樣品）形成沉淀前就停止了。樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規(guī)技術(shù)去除梯度材料后就得了某個較純的成份。每個單一組份的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數(shù)。
對于相類似的生物體組份常常形狀也相似。在速率—區(qū)帶離心中我們常常使梯度液的最大密度不超過在該梯度中的浮密度。利用這類生物體組份在尺寸上的差異而形成的沉降速率的不同，選擇某一特定時刻，當它們中的各個純樣品區(qū)帶之間的距離拉得最遠時停止離心即可以達到分離目的。
與速率—區(qū)帶離心法不同的是，等密度離心是依賴于樣品顆粒的不同密度來進行離心分離的�；旌蠘悠房梢凿佋谔荻纫褐�上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一種方法依靠離心力來形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的過程中由于樣品各單一成份向它們自己的等密度區(qū)靠攏即達到了分離純化的目的。對于速率—區(qū)帶離心，梯度液最大密度一般小于樣品中各組份的密度，也就是說是在樣品正在沉降過程中的不是在形成沉淀后來分離樣品；而等密度離心法中，梯度液的初始最大密度常常超過樣品各組份的密度，利用每個單一組份沉降或上浮到它們各自的等密度區(qū)來達到分離的目的。
密度梯度離心法的理論基礎(chǔ)是（參考文獻 1）
每種純樣品成份在梯度液中的沉降速度可以表達為：

式中：v是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）
         d：樣品顆粒的直徑（厘米），我們在初步計算時就假設(shè)樣品顆粒為球體。非球形顆粒樣品，可以以上式為基礎(chǔ)進行修正。
         σ：樣品顆粒的密度（克/厘米³）
         ρ：密度梯度液的密度（克/厘米³）
         η：密度梯度液的粘性系數(shù)（克/厘米•秒）
         ω：離心機主軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：轉(zhuǎn)/分
         r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）
當：σ>ρ時，v>0即樣品順離心力方向沉降
      σ<ρ時，v<0即樣品逆離心力方向上浮
      σ=ρ時，v=0即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定”在這一位置
用這個公式可以很好地解釋在速率—區(qū)帶離心法或等密度離心法中單一樣品的沉降（或上�。┬袨�。

二、轉(zhuǎn)頭的選擇：

1、離心轉(zhuǎn)頭分類：

（2）梯度材料的選用
        一個理想的梯度液應(yīng)具備：化學穩(wěn)定性好；高溶解度；低滲透性；在溶劑中的穩(wěn)定性；較低的光吸收特性；低廉等。遺憾的是很難找到一種適合于各種 R-Z離心的完美無缺的梯度液。
對于大多數(shù)R-Z離心，蔗糖是比較合適的梯度材料。盡管它在高密度（40~60% W/ W）時粘性系數(shù)較大，但綜合比較表明它可以廣泛應(yīng)用。但由于蔗糖在各種密度時（即使是低密度時也如此）有較高的滲透性，分離一些對滲透性敏感的生物體組份時需要選擇其他梯度材料，如由 Pharmacia公司開發(fā)的 Ficoll等等。
      在大多數(shù)情況下，梯度液的 PH值應(yīng)與被分離時生物制品的生理 PH值一致。
      對密度梯度材料的基本要求：
（a）能夠配制所需要的密度范圍
（b）粘性系數(shù)較低
（c）溶解度高
（d）有密度與光折射率的對照資料
（e）對被分離樣品無損害
（f）對被分離樣品滲透很少
（g）在離心分離完成后很容易與生物樣品分離
（h）化學性能穩(wěn)定
（i）對離心過程中所接觸的轉(zhuǎn)頭材料，離心管，管蓋及密封件，連續(xù)流及區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的管道等等無腐蝕作用。
（j）純度高
（k）毒性少
（l）價格較低
（m）已知該材料的某些物理、化學、熱力學性能。

常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸鉀、溴化鉀、碘化鉀、氯化銫、氯化銣、三氯醋銫、三氟醋酸銫、右旋糖苷、白蛋白、 Ficoll、Percoll、Metrizamide、 Nycodenz、Ludox、Dextran等等。
（3）梯度形狀的選擇
        所謂梯度形狀是指梯度介質(zhì)沿著離心管長度方向的密度變化特征。用于 R-Z離心密度梯度常用連續(xù)梯度也就是密度隨著離心半徑的增加而光滑地（不是突變地）增大，直線型的，光滑曲線型的（一般用凸指數(shù)或凹指數(shù)曲線，或凸凹指數(shù)曲線聯(lián)用的）都屬于連續(xù)梯度。不連續(xù)（階梯型）梯度多用于等密度離心。
●線性梯度：
在甩平轉(zhuǎn)頭中做 R-Z離心最常用線性梯度。
制備線性梯度時要注意：
在甩平或垂直轉(zhuǎn)頭中制備線性梯度時，梯度液面的密度必須足以支持樣品，而底部密度必須小于被分離樣品各個組份的密度。
一般地說較大的梯度斜率可以得到較高分辨率。
蔗糖的常用線性梯度范圍是 5~20%W/V或 10~40%W/V。
可以用梯度儀制備線性梯度，也可以人工鋪設(shè)數(shù)個階梯型梯度，離心管靜置一段時間后也可以形成近線性梯度。
●等運動梯度（等速梯度）（Isokinetic）
等運動梯度是指在某一恒定離心轉(zhuǎn)速時，樣品顆粒在梯度中以定常速度沉降。要做到等速沉降，必須使梯度液密度和粘性力的增加與沿著離心半徑方向的離心力增加相平衡，在這種梯度液中，顆粒的沉降距離與離心時間，離心力，以及顆粒本身的沉降系數(shù)成正比。因此如果已知某單一組份樣品的沉降系數(shù)，就可以算出在同一梯度中沉降的其他組份的沉降系數(shù)。
在甩平轉(zhuǎn)頭中用等速沉降梯度時，從旋轉(zhuǎn)中心算起的離心距離與沉降系數(shù)的關(guān)系應(yīng)該是線性關(guān)系。為了構(gòu)造等速沉降梯度我們必須注意到轉(zhuǎn)頭、離心管，梯度介質(zhì)的密度、濃度和粘性系數(shù)在同一溫度。
在甩平轉(zhuǎn)頭中作蛋白質(zhì)分離常用 5~20%（W/V）蔗糖梯度在 5℃離心可以達到近似的等速沉降的效果，而 10~30%（W/V）的甘油梯度在 5℃時 DNA或 RNA也可以達到近似等速沉降的目的，其他大多數(shù)樣品分離的等速沉降梯度是凸指數(shù)型曲線。
●凸型指數(shù)曲線與凹型指數(shù)曲線梯度：
為了支持樣品使其中組份在離心開始前不致于沉入梯度，我們常希望梯度曲線在近液面處有較陡的斜率，也就是說在近液面處梯度液的密度沿離心管長度方向增加得很快。這就是凸指數(shù)曲線梯度，與此相反，如果液面處梯度液足以支持（托住）樣品，故考慮到某些樣品在離心管中下部需要較慢的沉降率（在高密度區(qū)）才能得到理想的分辨率，那么凹型指數(shù)曲線型梯度便能滿足這個要求。
●復合型梯度：
如果用程序梯度儀來準備梯度，那么上節(jié)中的凸凹指數(shù)曲線梯度可以復合在同一梯度液中，這樣的復合梯度在它們各自的區(qū)域保持了它們各自的優(yōu)點。當然也可以制備其他類型的復合梯度。一般說，復合梯度多用于區(qū)帶離心。

2、等密度離心，梯度要素的選擇
（1）梯度材料及梯度溶液選擇
所有的等密度離心都使用水溶性緩沖劑作溶劑，緩沖劑的組成及 PH值取決于生物樣品的性質(zhì)。對細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)或其他生物大分子的等密度離心分離各有不同要求。
常用于等密度離心梯度材料有：

從上表可以看出，對 R-Z離心，蔗糖是很好的梯度材料，而對于等密度離心，不同的生物樣品對梯度材料的要求有較大差異。
（2）梯度型式選擇
離心時，溶液中的各組組份都同時處在離心場中，被分離的組份及梯度材料的分子都在離心力作用下向離心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、連續(xù)流轉(zhuǎn)頭）沉降。對于梯度材料，如果它們的沉降速度在離心初始階段遠大于濃度擴散速度，那么就可以形成連續(xù)的密度梯度。這就是“自形成梯度”產(chǎn)生的基本原理。我們可以把被分離樣品和梯度材料混合在一起離心，梯度材料在離心過程中形成密度梯度，而樣品中不同組份則沉降（或上�。┑剿鼈冏约旱牡让芏葏^(qū)。
另一種方法是預先制備好密度梯度，將樣品鋪在離心管（或區(qū)帶轉(zhuǎn)頭）的某一部份（如離心管上部、下部或中部）離心，使樣品中各種組份沉降（或上浮）到它們自己的等密度區(qū)前后，從而達到了我們所需要的“平衡”結(jié)果。
預先形成梯度可以是不連續(xù)的（階梯型），也可以是連續(xù)梯度。階梯型不連續(xù)梯度大多適用于從植物或動物組織的勻漿中分離整細胞或亞細胞器，或用于某些病毒的純化。而連續(xù)梯度由于其密度平滑地變化，對于某些生物樣品的多種成份組合的分離可以得到較高的分辨率因而得到了廣泛的應(yīng)用。
選擇自形成梯度還是預形成梯度，主要取決于材料的性質(zhì)。某些膠體硅材料可在10,000~20,000×g的離心場中離心30分鐘就可以自形成梯度（例如美國 Dupont公司的 Ludox及瑞典 pharmarcia公司的 Percoll）。但對某一些材料，自形成梯度的時間很長，對離心力的要求也很高。CSCL或 Metrizamide需要在50,000~500,000×g的離心場中離心數(shù)小時甚至數(shù)十小時才能自形成梯度（如用CSCL做質(zhì)粒 DNA分離，梯度液中加 E.B.和 Triton x-100，在 490,000×g需要離心4小時，才能利用CSCL的自形成梯度分離出質(zhì)粒DNA，染色體DNA，RNA和蛋白質(zhì)。）
預形成梯度的主要優(yōu)點是離心時間較短，因為我們只要考慮樣品中某個組份到達其等密。
預形成梯度的缺點是：
●被分離樣品的容量較少（與自形成梯度相比）
●對某些樣品如細胞或病毒會因單向沉降而產(chǎn)生顆粒聚結(jié)從而減少了樣品回手率甚至影響純度。
●預先制備梯度液需較長時間，亦較繁復。
與預形成梯度相比較，自形成梯度有較大樣品容積（特別是使用垂直剖面積較大的垂直管或近垂直離心這個優(yōu)點更突出）；可以簡單地調(diào)整初始密度；離心過程中樣品既有上浮又有沉降，也就是混在梯度液中的樣品在離心過程中，在梯度材料自形成梯度的同時從離心力的正反二個方向向自己的等密度區(qū)靠攏，最后排列在自己的等密度區(qū)上下形成純樣品區(qū)帶。從這個意義上說，樣品是真正到達了自己的等密度取而具有很高的濃度。
自形成梯度的等密度離心又稱平衡等密度離心（Eguilibrium-Isopycnic）
（3）自形成梯度
綜上所述，某些梯度材料能夠在離心過程中形成密度梯度， Ludox，Percoll中的膠體硅顆粒可以較快地向離心管管底（如甩平轉(zhuǎn)頭等）或外側(cè)（垂直管轉(zhuǎn)頭）沉降而另一些材料如 CSCL，CS2SO4，Metrizamide等則在沉降過程中受到其反向濃度擴散的影響，達到平衡的時間就特別長。平衡后梯度曲線的形狀不僅依賴于梯度材料本身，也取決于其他一些離心條件。自形成梯度的最基本條件是樣品中需要分離的各種組份在分離后都就包含在梯度范圍中。最佳的自行梯度形狀還應(yīng)該使被分離組份都處在各自的較窄的純樣品區(qū)帶內(nèi)，只有這樣才能得到較高的分辨率。使很多單一組份在尺寸和密度上都有差異，這就使得同種樣品區(qū)帶離心后顯得比較寬。為了提高分辨率就必須使梯度曲線變得陡一些，但要隨心所欲做到這一點卻很困難。
幸運的是對于所有梯度材料，計算自形成梯度的公式（也就是自形成梯度曲線的形成原理）是一樣的。由于 CSCL分離質(zhì)粒DNA已有近 30年的歷史，大多數(shù)定量分析工作集中于討論CSCL梯度。用下面的一些公式可以計算自形成梯度曲線的形狀，可用于設(shè)計最合適的密度梯度。
●梯度曲線的斜率：
密度梯度曲線中某一點的昀終斜率可以用dρ/dr下式計算：

其中：ω是弧度（弧度/秒）
         r：從旋轉(zhuǎn)中心到計算點的距離（cm）
         β°：梯度材料的密度梯度比例常數(shù)。
β°的數(shù)值請參考：
（1）余興明“質(zhì)粒 DNA的超速離心分離”或
（2）J.B.Martin “Biopolymers”9，1970，P597

用這個公式計算梯度曲線的中下部占3/4離心管中梯度高度的dρ/dr值比較接近實際情況，對
上部1/4長度與實際情況有些差別。
從上面公式可以看出，要使曲線變陡：
a：降低β°
b：提高轉(zhuǎn)速
c：加大離心半徑
d：增大初始密度
以同等轉(zhuǎn)速離心，甩平轉(zhuǎn)頭的 r較大，在同等初始密度條件下，甩平轉(zhuǎn)頭的密度梯度曲線比垂直管轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭或固定角式轉(zhuǎn)頭都要陡一些。（參見下圖）

CSCL初始密度為 1.72g/cm3時的自形成梯度曲線

九十年代以前生物大分子離心分離實驗多數(shù)是利用甩平轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速在60,000rpm以下，某些實驗一次要離心數(shù)十小時，使用的CSCL也較多（分析純，價格高，且不能反復使用）離心分離成本昂貴（如80年代初期，質(zhì)粒DNA分離，CSCL初使密度為1.71g/cm³，33,000rpm， 20℃甩平轉(zhuǎn)頭離心72小時，一次離心就用去了驅(qū)動部1.4億轉(zhuǎn)的壽命，而當時的超速離心機驅(qū)動部的保用壽命才100億轉(zhuǎn)，雖然由于CSCL在離心后梯度曲線較陡而獲得了很純的質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA，但成本實在是太高了）。九十年代開始使用近垂直管（或稱小角度）轉(zhuǎn)頭，在 CSCL梯度中加入 E.B.和 Triton x-100，初始密度 1.55g/cm³、78,000rpm，20℃離心4小時（用去驅(qū)動部壽命0.187億轉(zhuǎn)）或用垂直管轉(zhuǎn)頭，同樣的梯度 100,000rpm，20℃2小時（用去驅(qū)動部壽命0.12億轉(zhuǎn)都獲得了滿意的結(jié)果。（文獻 5）
●梯度的密度范圍：
在不同距離處（r₂，r₁）密度差可以用下面公式表示：
從上式可以看出（ρ₂-ρ₁）值不僅和轉(zhuǎn)速的平方而且和距離的平方差成正比。
●轉(zhuǎn)頭選擇對梯度曲線斜率與梯度范圍時影響：從前面的曲線圖可以看出對不同轉(zhuǎn)頭，梯度曲線的差異：水平轉(zhuǎn)頭離心時和復原（離心完成）后對于梯度來說，離心管中液面至管底距離保持不變。對固定角式，小角度轉(zhuǎn)頭及垂直管轉(zhuǎn)頭，離心頭沉降距離很短，而在離心后復原時這項距離明顯拉長了，也就是說梯度曲線變得平緩了，這種距離的延伸有利于離心分辨率的提高。因此垂直管轉(zhuǎn)頭比NVT（近垂直管）轉(zhuǎn)頭，NVT轉(zhuǎn)頭比角式轉(zhuǎn)頭的距離延伸更大，分辨率也就更高。但與此相反，純樣品帶的寬度都是甩平轉(zhuǎn)頭最窄，垂直管轉(zhuǎn)頭最寬。
●梯度中的最大和最小密度：
計算前，首先要找到等密度點的位置。
等密度點：離心后密度與離心開始時初始密度相等的點。
對于甩平轉(zhuǎn)頭：設(shè)等密度點為 rc

式中：r_t梯度表面與旋轉(zhuǎn)中心距離
         r_b離心管底與旋轉(zhuǎn)中心距離
該公式可用于估算離心結(jié)束時（轉(zhuǎn)頭剛開始減速時）角式轉(zhuǎn)頭及垂直管轉(zhuǎn)頭的 rc位置。設(shè)梯度液初始密度（均勻）為ρ i，在求得 r_c后梯度中最大密度與最小密度可用下式計算：

如果已經(jīng)設(shè)計好密度變化范圍就可以計算所需要的離心轉(zhuǎn)速：

 
●計算實例：
DNA分離，CSCL梯度，初始密度 1.70g/cm³，根據(jù)離心要求，理想的最大密度為ρ_b=1.75g/cm³，最小密度為ρ_t=1.65g/cm³
用某甩平轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速55,000rpm，r_b=12cm，r_t=6.7cm則 N=45,500rpm，
校核：由于密度＞1.2 g/cm³按規(guī)定這個轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速不能超過：

46,200rpm＞45,500rpm所以設(shè)計成立。
●離心時間計算：
計算例題中離心所需要的時間：
已知 r平均=9.35cm，樣品 S_20.w=15

●討論必須注意不能使 CSCL在離心管底部最大密度超過 1.9 g/cm³， 20℃，否則CSCL將可能析出結(jié)晶，而CSCL的結(jié)晶密度為4 g/cm³，很可能在結(jié)晶的局部損壞塑料離心管，從而造成CSCL泄漏而進一步腐蝕轉(zhuǎn)頭，（特別是鋁合金轉(zhuǎn)頭）而造成轉(zhuǎn)頭在離心中炸裂的嚴重事故。為安全起見，重金屬的梯度實驗不要在鋁合金轉(zhuǎn)頭或甩平轉(zhuǎn)頭中的鋁合金吊桶中做。
（4）預形成梯度
●不連續(xù)（階梯型）梯度：
分層鋪設(shè)不連續(xù)梯度，樣品鋪在梯度液之上，離心時不同組份越過小于本身浮密度時梯度層次而最后到達密度大于樣品浮密度的梯度界面之前形成純樣品區(qū)帶。一般設(shè)置三至五個層次。
●連續(xù)梯度：
根據(jù)被分離樣品的性質(zhì)設(shè)計線性、凸指數(shù)、凹指數(shù)或凹凸復合指數(shù)曲線梯度。樣品一般鋪在梯度液上部離心分離，要注意的是某些梯度材料（如重金屬鹽）預形成梯度在離心過程中由于離心力和濃度擴散的復合作用而可能改變形狀。我們也可以用離心來制備預形成梯度，如果形成的梯度曲線（近直線型）中點的密度和初始密度相同則梯度的穩(wěn)定時間（對 CSCL）
T=0.3 (r_b −r_t )² （小時）
當然這是用于估計形成不同 CSCL梯度曲線所需要的時間的經(jīng)驗公式。它可用以實際離心操作。
（5）為了使實驗人員對不同生物體在不同梯度材料中的浮密度有初步認識，下列圖供參考圖中：
a.在水或在 0.25M蔗糖液中的推定浮密度
b.在等密度蔗糖液中推定浮密度
c.在等密度 CS2SO4中推定浮密度
d.在等密度 CSCL中推定浮密度

附圖各種生物體組份在不同梯度材料溶液中的浮濃度示意

參考文獻：
[1]B.D.Hames “Choice of Conditions for Density Gradient Centrifugation” IRL press.oxford 1984
[2]M.Dobrota,R.Hinton “Conditions for density gradient Separations” Oxford University press.1992
[3]D.Rickwood,B.D.Hames “Centrifugation ,Essential Data”Wiley press.1994
[4]C.A.Price “Centrifngation in density gradients”Academic press.New York 1982
[5]余興明，“質(zhì)粒 DNA的超速離心分離”——“生命的化學” 1994.1
[6]余興明“血清脂蛋白的離心分離”——“生命的化學”1997.3
[7]余興明“離心技術(shù)”設(shè)備與方法概論——上海生物物理學會 1986，1993年

作者：余興明   電話：13764301893,