生物大分子的離心分離實(shí)驗(yàn)

一、引言

在八十年代以前，生物大分子（特別是核酸、蛋白）用離心方法分離純化占有很重要的地位。用分析超離心方法測(cè)定生物大分子的分子量、沉降系數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)、微分比容等在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中也占有一席之地。八十年代以后，由于離心技術(shù)的快速發(fā)展（微處理器的引入，變頻驅(qū)動(dòng)的完善、轉(zhuǎn)速的提高等等），先進(jìn)的制備用超速離心機(jī)已經(jīng)能夠替代昂貴的分析機(jī)型完成M.S.D 等參數(shù)的測(cè)定。分析超速離心機(jī)在實(shí)驗(yàn)離心技術(shù)領(lǐng)域轉(zhuǎn)向與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如NMR，x 衍射等）結(jié)合研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能。

進(jìn)入九十年代，電泳技術(shù)的發(fā)展使得原來(lái)用離心技術(shù)來(lái)測(cè)定生物大分子分子量的方法又變得落后了。用電泳技術(shù)測(cè)定分子量M.方法簡(jiǎn)單、快速、成本較低（文獻(xiàn)2， 3）。而近年來(lái)用核酸與蛋白的快速測(cè)序方法來(lái)測(cè)定生物大分子的一些參數(shù)，比用離心法、電泳法更先進(jìn)，精度更高。（文獻(xiàn)4，5）

盡管如此，離心分離方法還是以它的部分優(yōu)勢(shì)存在著：分離范圍廣，容量大；可以研究天然生物大分子的流體動(dòng)力學(xué)特性；可以在電離介質(zhì)中進(jìn)行生物大分子的片段分離；對(duì)緩沖劑限制很�。ㄔ陔娪炯夹g(shù)中由于電流的熱效應(yīng)而限制了緩沖劑的使用）等等。另外在各種實(shí)驗(yàn)方法的前處理階段，離心法還是被廣泛的使用著。考慮到各個(gè)研究部門的設(shè)備分布情況，在很多條件下，離心分離的使用還具有相當(dāng)?shù)膹V泛性。作為有效的分離純化方法，差分離心、速率區(qū)帶密度梯度離心和等密度離心在生物大分子的研究中還占有重要地位（文獻(xiàn)1）。

二、生物大分子的離心分離要點(diǎn)：

（1） 防止污染：

要避免在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于生物大分子部分受損而引起降解或變性，引起降解的原因很多，如實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的外力作用；某些酶污染等等，但最常見的原因是酶的作用。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于污染某些脫氫酶進(jìn)入樣品而使生物大分子變性。

避免的方法：

（i）用抑制劑來(lái)降低脫氫酶的作用：常用的抑制劑有DFD（二異丙基磷酸氟）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、EDTA（1~10mM ）、SDS（0.1~1% ）、DEPC（焦碳酸二丁酯）（0.1%）……。

（ii）對(duì)所有接觸樣品的容器（離心管、管蓋組件、移液器、移液管等等）進(jìn)行徹底消毒（蒸汽消毒或0.1%DEPC 侵泡）。

（iii ）由于實(shí)驗(yàn)人員皮膚表面有酶存在，所有實(shí)驗(yàn)必須使用經(jīng)過(guò)消毒的手套操作。

（iv）合適的PH 值：過(guò)度的酸堿度也會(huì)使生物大分子降解。

（2） 避免變性的其他注意事項(xiàng)：

（i）轉(zhuǎn)頭在離心前預(yù)冷到接近離心溫度（在冰箱中放置過(guò)夜，或在恒溫箱中保溫）。對(duì)于超速離心機(jī)，其制冷系統(tǒng)主要用于抵消轉(zhuǎn)頭在稀薄空氣中高速運(yùn)轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)頭表面線速度從亞因速—>超因速）時(shí)氣動(dòng)力摩擦產(chǎn)生的熱量。在真空中，只有輻射傳熱的情況下，高速運(yùn)轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)頭溫度從室溫（如夏天30~35℃）降到5℃時(shí)間很長(zhǎng)（如1 小時(shí)左右）一般應(yīng)預(yù)冷到接近離心溫度（±2℃）以確保在離心的最初階段（15 分鐘以內(nèi)）轉(zhuǎn)頭溫度和樣品溫度一致。

（ii）用固定角式或近垂直管轉(zhuǎn)頭或垂直管轉(zhuǎn)頭作梯度離心時(shí)必須利用離心機(jī)的慢加速（0~500rpm ）、慢減速（500rpm~0）功能，以保證梯度方向的順利轉(zhuǎn)換。

（iii）離心開始、離心結(jié)束都要小心地輕放和輕取離心管，避免大的震動(dòng)。

（iv）卸樣過(guò)程應(yīng)在無(wú)震動(dòng)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行，環(huán)境溫度和離心溫度相近，卸樣方法應(yīng)選擇平穩(wěn)、外力作用很小的方式，盡可能不用泵輸送樣品。

（3） 有關(guān)梯度離心的其他要點(diǎn)：請(qǐng)參照文獻(xiàn)（8）（9），本文略。

（三）生物大分子的離心分離實(shí)例：

例（1）去蛋白的RNA 分離：

（i） 樣品勻漿加入9 倍容積的冰冷20mM Tris-HCl（ PH8.0 ） 1mMEDTA 。

（ii） 加入1/10 容積的10% SDS，再加入等容積的（苯酚：氯仿：異丙醇）（容積比50：50：2）溶液并含有0.1% 的8-羥基喹啉溶液充分混合使其乳化。

（iii） 以上溶液在10,000xg 離心10 分鐘。

（iv） 移出上清液，重復(fù)（ii）（iii）過(guò)程一次。

（v） 第二次離心后上清液中加入1/10 容積的3M 醋酸銨，充分混合后再加入二倍容積的乙醇，并在-20℃靜置二小時(shí)以上。

（vi） 10,000xg 5℃離心10 分鐘得到RNA 沉淀。

（vii） 用干燥的N2 氣體蒸發(fā)掉沉淀中殘留的乙醇。

（viii） 將RNA 溶于20mMTris-HCl（PH8.0），1mMEDTA 中，-20℃低溫保存待用。

例（2）從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA：

（i） 溶液制備：

溶液I：50mM 葡萄糖，10mM（EDTA），25mM Tris-HCl（PH8.0）

溶液II：0.2M NaOH，1% SDS

溶液III：3M 醋酸納（PH4.8）

TE 緩沖液：10mMTris-HCl（PH7.4），2mM EDTA

（ii）E. Coli 培養(yǎng)液1 升（量大按比例配置）

（iii）將1 升培養(yǎng)液在4,000rpm（約2,000xg），5℃離心20 分鐘，得到細(xì)菌沉淀。

（iv）用100ml 冰冷的溶液I“洗”沉淀，再次離心，4,000rpm，5℃， 20 分。

（v）用20ml 冰冷溶液I 將第二次離心沉淀調(diào)成均勻懸浮液。

（vi）每ml 懸浮液加入2mg 溶菌酶，并在0℃冰浴中放置10 分鐘。

（vii）加入40ml 溶液II，輕輕攪拌后，在冰浴中放置5 分鐘。

（viii）加入30ml 溶液III，在冰浴中放置20 分鐘，使蛋白質(zhì)大部分沉降。

（ix）在高速冷凍離心機(jī)上用角式轉(zhuǎn)頭，10,000rpm（約10,000xg ）離心15 分鐘，5℃。

（x）小心地倒去上清（不擾動(dòng)沉淀），在沉淀中加入55ml 異丙醇， 即得到粗制的質(zhì)粒DNA 溶液。

（xi）粗制DNA 液在-20℃靜置15 分鐘以上，再在12,000rpm（約15,000xg）4℃離心5 分鐘，倒去上清液。

（xii）真空中抽去異丙醇，沉淀中加入18ml 經(jīng)過(guò)消毒的TE 緩沖液， 在沉淀溶解后再加入0.65ml，1% E.B.

（xiii ）以上溶液每ml 加入分析純CsCl 1 克，使其完全溶解，檢測(cè)溶液折射率應(yīng)為1.3890（密度≈1.587）

（xiv ）用以上溶液按照參考文獻(xiàn)（6）所介紹的方法作質(zhì)粒DNA 分離。

（xv）離心后在300nm 紫外光下可顯示DNA 帶（線性DNA 帶和質(zhì)粒DNA 帶，RNA 沉淀在底部，蛋白質(zhì)浮在液面）。

（xvi）用文獻(xiàn)（1）介紹的方法取出質(zhì)粒DNA，抽提去掉E.B. 透析法或脫鹽柱去除CsCl 。

例（3）用CsCl 梯度分離DNA 并測(cè)定其組成（% G+C）

（i）CsCl 溶液密度D 與溶液中CsCl 的重量百分比濃度P 之間的關(guān)系： D=138.11/（137.48-P）

（ii） 制備初密度為1.706 克/毫升的梯度液，應(yīng)按以下要求配置

·4.85 克CsCl （分析純）
·50μl ，1.0M Tris-HCl（PH7.4）
·20μl， 0.2M EDTA（PH7.4）
·0.5ml DNA 樣品

·3.3ml 重蒸水

（iii） 用光折射儀檢測(cè)CsCl 的初始密度D，設(shè)測(cè)得的光折射率為RI，則有 D=10.8601×RI-13.4974

（iv） 測(cè)得的RI 應(yīng)為1.4000，如果檢測(cè)值大于此值，再加重蒸水容量為V（毫升），梯度液的總?cè)萘繛?SPAN lang=EN-US>G（毫升） V=1.52×G×（D 測(cè)定-D 需要） 如果檢測(cè)值小于1.4000，那么再加固態(tài)CsCl（W）克W=1.32×G×（D 需要-D 測(cè)定）

（v） 再測(cè)溶液折射率直至調(diào)整RI=1.4000

（vi） 將配置好的液體充滿于5ml 的一次性快速密封離心管，并利用封口機(jī)密封。

（vii） 固定角式轉(zhuǎn)頭150,000xg ， 20 ℃離心50~55 小時(shí)（約35,000rpm）或垂直管轉(zhuǎn)頭300,000xg，20℃離心12 小時(shí)（約55,000rpm ）

（viii） 離心后利用梯度儀或手工收集成50 管（每管100μl）。

（ix） 對(duì)每管樣品測(cè)定折射率至小數(shù)4 位，測(cè)試過(guò)程中應(yīng)保持樣品溫度為20℃，根據(jù)折射率RI 計(jì)算各管樣品的密度D。

（x） 每管中加1 毫升重蒸水，在260nm 波長(zhǎng)時(shí)分別測(cè)各管光密度（OD），如果DNA 已做了同位素標(biāo)記，那么還要對(duì)收集的樣品分別做液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定輻射值。

（xi） 以離心管容量為橫坐標(biāo)（從管底至管面），分別以各管測(cè)得的OD 值或同位素放射計(jì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作曲線。找到曲線的峰值位置即可做DNA 定位。

（xii） 用下式計(jì)算DNA 組成：

%（G+C）=（D-1.66）/0.098×100 如果能在離心樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)DNA，計(jì)算就更加準(zhǔn)確。

說(shuō)明：

·進(jìn)入90 年年代以后用DNA 測(cè)序法或在260nm 波長(zhǎng)加溫溶點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定比離心法更簡(jiǎn)單，究竟用什么方法要由使用單位現(xiàn)有設(shè)備來(lái)決定。

·在不用E.B.（溴乙錠）的情況下，用CsCl 梯度分離DNA 一般不會(huì)影響DNA 的構(gòu)型。

·某些梯度材料如Cs2SO4 在離心過(guò)程中形成的密度梯度太陡而不適合做質(zhì)粒DNA 離心。

·某些非電離性的梯度材料（如Nycodenz ）也不適用于此類離心。