關(guān)于密度梯度離心有關(guān)問題的補(bǔ)充說明
YU 2005.3
（一）離心管及轉(zhuǎn)頭密度梯度制備
① 手工制備；是主要的也是常用的方法
i 階梯形梯度制備：配置不同密度的梯度液（與離心溫度相同），用帶恒溫裝置的阿貝折射儀檢測各密度層折射率用于檢測密度的正確性，按照由濃至稀薄的順序分層鋪在離心管中；再在梯度液上部或底部鋪樣品。
ii 線性梯度手工制備：把連續(xù)梯度分成（5～10）段不等密度，按照密度的高一低順序分層鋪在離心管中，根據(jù)梯度材料不同而在室溫中靜止存放數(shù)小時或過夜；利用梯度材料在重力作用下的濃度擴(kuò)散形成近線性梯度。
iii 線性梯度凍溶制備；配置平均密度 
的等密度液，放在低溫冰箱中凍結(jié)（一般過夜或數(shù)小時）全部凍結(jié)后取出室溫溶化，全部溶化后再放在冰箱中凍結(jié)，再靜置溶化后可以形成近線性密度梯度。
② 自制簡單梯度儀制備：取二個直徑相同的玻璃燒杯，請燈工聯(lián)接底部，聯(lián)通管的 中部加旋塞開關(guān)，將最高密度梯度材料和最低密度材料分別置于不同燒杯（注意，二個燒杯中梯度液相加的總?cè)萘康扔陔x心管單管梯度液容量）。濃液燒杯中放置螺旋攪拌器，將管道泵的抽出管置于濃杯底部，打開二個杯中間旋塞開關(guān)，開動攪拌器及管道泵。抽出至離心管中，直至抽完。這個方法適用于單管容量較大（10ml 以上）的梯度制備、如果管道泵輸出有多管分液器，可以用于多管制備，此時二燒杯容量和籌于多管容量之和。
③ 用廠商提供的自動梯度儀制備可以同時制備單管或多管（多至6 管）。如果盛放梯度液的容器直徑不同則可以制備曲線梯度，（如高濃度杯直徑大，可制備凸指數(shù)梯度如低濃度杯直徑大，則可制備凹指數(shù)梯度。凸指數(shù)梯度可提高高密度區(qū)分辨率，凹指數(shù)梯度可提高低密度區(qū)分辨率）
④ 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭及連續(xù)流轉(zhuǎn)頭的密度梯度制備（參考梯度取出第⑦部分說明）
⑤ 利用某些梯度材料在離心過程中自形成梯度的特點制備密度梯度【參考“離心技術(shù)講座”文獻(xiàn)第18）】
（二）密度梯度離心后梯度液的取出方法
① 離心管底部穿孔后分滴收集：較大容量注射器針頭倒放在空管中（空管內(nèi)徑比離心管外徑稍大），離心管順空管柱下用力刺破管底后松管蓋后往下滴液，手工或用計滴（或計時）分部收集器收集后分管作吸光度測量，并繪出容量一吸光度曲線定位。
特點：用于看不清純樣品帶的離心；方法簡單可行；層次間有少量混浠（特別是低密度液體）影響分辨率；離心管一次使用，成本稍高；適用于薄壁PA，PP， PPCO， PET 管，不適用于PC 管、各種厚壁管、金屬離心管及離心瓶；收集后的吸光度測定和容量－吸光度曲線繪制費時、繁復(fù)。
② 手工上取：開口管傾斜20°～30°，用定量吸管沿內(nèi)壁液面處緩緩吸出注入收集管，換吸頭再重復(fù)吸出，一層層往下收集。
特點；簡單可行；一般5ml－40ml 離心管可收集成50～100 管，在容量一吸光度曲踐上每收集管有一點。如果梯度離心后會形成三個以上的純樣品帶，收集的管數(shù)可能要增加到100~200 管才能給繪成比較完整的峰值曲線，和下部穿孔取樣一樣簡單但是非常繁瑣，工作量很大；適用于各種離心管、厚壁管、或離心瓶，使用熔封密封管、指壓管或快封管時要削去管的肩部以上部分，會影響液柱的整體性。
③ 側(cè)壁穿刺取樣：對于可見純樣品帶的實驗（如質(zhì)粒DNA，染色體DNA，線粒體等）；可將離心管套在一個開有側(cè)狹縫的空管中用注射器從側(cè)面穿刺進(jìn)入離心管，緩速抽出。
特點：直接抽出所附要的樣品成份；回收率以80％左右；分辨率取決于操作水平；只適用于薄壁的PE，PA，PPCO，PET 管；離心管一次性使用；不適用于不顯色的樣品。
④ 用特制的取出梯度密封蓋，細(xì)管插入管底，從上部用蠕動泵泵入高密度排擠液，從密封蓋上部側(cè)向開口排出梯度液。梯度取出是從低密度到高密度依次而出。排出口可以聯(lián)接分光計流動池再接分部收集器，也可以用手工分管收集。
特點：用于開口管，不損壞離心管；密封蓋制作比較復(fù)什；上部取出次序是從低密度到高密度可以保持較高的分辨率和回收率；一般不用于密封管、快封管和指壓管；梯度取出后的流動池連續(xù)吸光度測定和聯(lián)接分部收集器可一氣呵成，省時省力。
⑤ 用密度梯度分部制備一收集儀上取：一些廠商提供了自動的多管梯度制備和單管上取收集儀器（如日立的DGF—U），非常適合做開口管的密度梯度上取→分光計流動池吸光度測量→繪制容量→吸光度曲線→自動分部收集的一體化自動取出和測定。自動梯度儀的上取管聯(lián)接著液面高度探測器，可以自動地在一邊往上吸的同時吸管往下移動，它附有管道泵，可以在很大范圍內(nèi)調(diào)整抽取速度。
特點：自動化程度高，省時，省力；分辨率和回收率都很好：適用于各種離心管、瓶；用于溶封管，指壓管及快封管時只要削去管肩上部一小部分，基本上不影響液柱的整體性；分光計沒有流動池時也可以手工收集；儀器還可用于多管（1～6 倍）梯度制備；設(shè)備投資稍高。
⑥ 用玻璃毛細(xì)管慢慢插入管底，毛細(xì)管上部聯(lián)接蠕動泵軟管用蠕動泵抽出再分部收集，或直接聯(lián)向分光光度計流動池連續(xù)測量吸光度并同時繪出曲線，峰值所在即為某幾個已純化的樣品所在位置，通過流動池后再用分部收集器或人工收集。
特點：梯度抽出次序是從高密度到低密度，為了減少層間干擾，插入時要緩慢插入和必須緩慢抽出；對各種材料的開口管、厚壁管、離心瓶都可以多次使用（不破損離心管），也可用于快封管、指壓管、熔封管（一次性使用管），抽出前須用刀片切去密封口。由于高密度向低密度的抽出往往會引起離心管內(nèi)不同層次梯度液的混合，降低分辨率，一般不推薦給初次使用者。
⑦ 轉(zhuǎn)頭（區(qū)帶、連續(xù)流）密度梯度離心后梯度液的取出：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的梯度制備、加樣和梯度取出卸樣過程都是在低速運轉(zhuǎn)情況下實現(xiàn)的（2,000~3,000rpm），由特制的密封加樣一卸樣裝置和密度梯度泵來實現(xiàn)密度梯度液的制備和排出。用管道泵輸入樣品。排出液聯(lián)到帶流動池的分光計后由分部收集器收集。部分超速連續(xù)流離心產(chǎn)品（如日本Hitachi 的變頻驅(qū)動的大容量超速連續(xù)流裝置CC－40；美國Alfa－Wasserman 公司壓縮空氣驅(qū)動的同類超速連續(xù)流裝置KII）可以在靜止?fàn)顟B(tài)下加入梯度液，利用離心機(jī)的慢加速把水平梯度轉(zhuǎn)換成垂直梯度然后轉(zhuǎn)頭升速至超速（40,000rpm 以下）后連續(xù)加樣。離心完成后快減速至低轉(zhuǎn)速，慢減速完成轉(zhuǎn)頭內(nèi)液體的垂直梯度向水平梯度轉(zhuǎn)換，停轉(zhuǎn)后從轉(zhuǎn)頭下部從部泵出梯度液再聯(lián)接到分光計流動池檢測后自動分部收集。
（三）離心后梯度物質(zhì)中純樣品區(qū)帶的檢測方法
l 可顯色材料（如加E.B. 的質(zhì)粒DNA 樣品帶，染色體樣品帶，線粒體樣品帶）的直觀肉眼觀測。
l 某些樣品在紫外光照射下顯色的直觀觀察。
l 分部收集后分別用光鏡或電鏡觀察（如細(xì)胞、亞細(xì)胞構(gòu)造，病毒等等）。
l 分光光度計流動池（儀器收集）或標(biāo)準(zhǔn)池（人工收集）吸光度測定，容量一吸光度曲線繪制后根據(jù)峰位置定位純樣品區(qū)帶所在的分部收集管。一般核酸，核蛋白體檢測用波長260nm；細(xì)胞，質(zhì)膜及亞細(xì)胞構(gòu)造用540nm 都可以獲得滿意的結(jié)果。
l 用放射性同位素標(biāo)記然后用相應(yīng)的儀器檢測（如液閃計數(shù)或γ計數(shù)器）。（文獻(xiàn)2）
l 用特定的酶標(biāo)記（如亞細(xì)胞構(gòu)造，細(xì)胞器的內(nèi)膜等）。（文獻(xiàn)3）
（四）轉(zhuǎn)頭、離心管的選擇
l 轉(zhuǎn)頭選擇：速率一區(qū)帶（Rate-Zonal）沉降密度梯度離心：選擇甩平轉(zhuǎn)頭及垂直管轉(zhuǎn)頭，大容量選擇區(qū)帶轉(zhuǎn)頭。
l 速率－區(qū)帶上浮密度梯度離心，小容量以甩平轉(zhuǎn)頭為主，大容量用區(qū)帶離心轉(zhuǎn)頭；其他各種型式轉(zhuǎn)頭（固定角，垂直管，小角度）也可以試用。等密度離心（Isopycinc ）小容量用垂直管轉(zhuǎn)頭、大容量區(qū)帶轉(zhuǎn)頭是優(yōu)選；對于生物大分子的等密度離心可選用小角度或固定角式轉(zhuǎn)頭；對于細(xì)胞和亞細(xì)胞構(gòu)造及病毒的等密度梯度離心選用甩平轉(zhuǎn)頭。（主要選擇轉(zhuǎn)速在4 萬轉(zhuǎn)/分、容量6×12～13ml 的甩平轉(zhuǎn)頭）
l 離心管：選擇可以反復(fù)使用，梯度制備和梯度取出都很方便的薄壁開口管為主，（PA 管使用最廣泛）；各種厚壁管、（可以只加一部分樣品，保持最大離心力，縮短離心時間）離心瓶和各種密封瓶為輔。選擇離心管應(yīng)考慮用什么方法制備和取出梯度；材質(zhì)耐藥性和消毒方法；選擇何種轉(zhuǎn)頭、轉(zhuǎn)速水平及其他因素。要仔細(xì)閱讀轉(zhuǎn)頭樣本上每一個轉(zhuǎn)頭使用哪些離心管和相應(yīng)的最高轉(zhuǎn)速、密封方法，（當(dāng)然這些問題在選購離心機(jī)決定配置時就應(yīng)該考慮周全）。密封管雖然能用到超離最高轉(zhuǎn)速（如l0 萬轉(zhuǎn)/分），但因為只能一次性使用，制備和取出梯度較困難，在使用上受到一定限制。開口管和密封管都必須加滿和密封。厚壁管可以不加滿，某些厚壁管可以在最大容量之內(nèi)隨意加樣；離心瓶一般加到肩部以上；用甩平轉(zhuǎn)頭時梯度液和樣品容量總和的液面應(yīng)控制在管口下3mm，（離心時液面是彎月面，3mm 的空隙在離心時可使管壁處液面距管口1mm，既不會使液體溢出，又保證了液體支撐住離心管壁而不致于在強(qiáng)大離心力作用下向內(nèi)翻卷）
（五）其他要注意的問題；
l 梯度上（或下、或中）樣品的加樣量：為了提高分離的分辨率以保證純度，加樣量一般控制在離心管實際總?cè)萘康?SPAN lang=EN-US>2％～5％，濃度高的樣品加樣量少一些，濃度低的樣品加樣量可以多一些，對連續(xù)梯度離心都應(yīng)控制在這過個范圍內(nèi)。有個例外是使用階梯梯度分離樣品，可以根據(jù)實際情況提高加樣量。特別是在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中使用階梯梯度離心。加樣量甚至可以高達(dá)轉(zhuǎn)頭容量的10％～30％（如各種疫苗生產(chǎn)的全病毒或抗原蛋白的純化制備等）。
l 離心溫度的選擇和轉(zhuǎn)頭預(yù)冷：
A：離心溫度選擇的原則是：
（1） 保證被分離樣品的品質(zhì)（特別是酶類樣品）常用4℃一5℃。
（2）保證重金屬鹽在強(qiáng)大離心場中不產(chǎn)生結(jié)晶。常用18℃～ 22℃，使用8 萬轉(zhuǎn)／分轉(zhuǎn)速以上時用分時段逐級降速的分步離心法，避免結(jié)晶生成。
（3）在使用有機(jī)溶劑時要保證低溫不揮發(fā)、或少揮發(fā)，不產(chǎn)生氣溶膠（當(dāng)然，也要同時考慮離心管、瓶、適配器和轉(zhuǎn)頭的良好密封）。
B：梯度的同溫檢測：由于配置的同濃度梯度材料的密度，光折射率和粘性系數(shù)、滲透率在不同溫度時都有很大變化。而一般檢驗密度值都用阿貝折射儀，所以折射儀應(yīng)配有恒溫設(shè)備，設(shè)定溫度應(yīng)該與離心溫度相同。
C：轉(zhuǎn)頭應(yīng)預(yù)冷到接近離心溫度。超速離心轉(zhuǎn)頭一般不用時都儲存在3℃～4℃冰箱內(nèi)， 用于18℃～22℃離心應(yīng)提前一天取出轉(zhuǎn)頭在室溫平衡。高速離心應(yīng)事先把轉(zhuǎn)頭放在冰箱內(nèi)過夜或在離心腔內(nèi)低速預(yù)冷到接近離心溫度后再加樣。
注意：超速離心轉(zhuǎn)頭在部分真空中旋轉(zhuǎn)，與離心腔內(nèi)壁的傳熱主要依賴熱輻射，在部分真空中對流換熱量很小。依靠輻射傳熱，降溫很慢，所以超速離心轉(zhuǎn)頭在離心腔內(nèi)長時間預(yù)冷是非常不合理的。超速離心機(jī)的制冷系統(tǒng)主要用于抵消在部分真空中高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)頭與稀薄空氣摩擦產(chǎn)生的熱量，而不是用來冷卻溫差很大的轉(zhuǎn)頭。在任何高、超速離心機(jī)實驗室中配備低價值的冰箱是非常合理的。超速離心機(jī)在較高真空情況下用紅外測溫可以達(dá)到較高的精度（±0.5℃以下）， 而高速離心機(jī)在大氣中旋轉(zhuǎn)或在低真空中旋轉(zhuǎn)（1/3～1/2 大氣壓），無法準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)頭溫度。如果離心機(jī)有溫度自動補(bǔ)償軟件（即直接顯示轉(zhuǎn)頭溫度），用戶隨時可知道轉(zhuǎn)頭（接近樣品）的實際溫度。如果用戶使用的是沒有溫度自動補(bǔ)償軟件的離心機(jī)，比較合理的處理方法是預(yù)冷轉(zhuǎn)頭。（如果不預(yù)冷轉(zhuǎn)頭，這類離心機(jī)顯示的溫度在開始離心的半小時內(nèi)和轉(zhuǎn)頭實際溫度相差很大）。
l 防止污染：
A：防止操作過程中接觸樣品的器具（離心管，管蓋，轉(zhuǎn)頭部件，連續(xù)離心或區(qū)帶離心的加樣系統(tǒng)。各種密封啳，管道）污染樣品。它們都必須清洗、消毒，操作人必須戴消毒過的手套加樣和卸樣。防止酶類降介生物大分子組分，防止各種細(xì)菌、細(xì)胞污染被分離的樣品，防止離心管材料與樣品中的溶劑起作用而污染樣品或造成離心管破壞等等。當(dāng)然，用什么清洗劑要嚴(yán)格按照使用說明書或有關(guān)資料處理。
B：防止樣品污染實驗室或者對實驗人員造成傷害：－般離心機(jī)都不能使用易燃、易爆樣品。但如果必須使用時要考慮降低離心溫度（減少揮發(fā)）和確保離心管、瓶、和轉(zhuǎn)頭的密封，絕對不能讓易爆、易爆氣體擴(kuò)散到離心腔內(nèi)。離心有毒、有害樣品（病毒、細(xì)菌、某些基因等等）、或樣品中必須添加有害化學(xué)品（如生物大分子離心中加E.B.），操作時除了戴手套、面罩、防護(hù)眼鏡以外，要特別注意密封操作，離心管加樣頭、手套一次性處理，實驗室內(nèi)事故沖洗，沖眼設(shè)備要齊全。
對毒害樣品的離心，加樣，卸樣，（包括轉(zhuǎn)頭密封安裝）可以在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行（超速離心轉(zhuǎn)頭有非常好的密封性能。即使由于某種原因離心管損壞，密封失效。操作不當(dāng)?shù)纫鸲竞悠仿┏鲭x心管但不會漏出轉(zhuǎn)頭外）。不要把臺式離心機(jī)放在生物安全柜內(nèi)操作。因為生物安全柜有自己特定設(shè)計的氣流走向，一臺低溫離心機(jī)的制冷系統(tǒng)有多個用于冷卻的風(fēng)扇，強(qiáng)力的排風(fēng)會影響生物安全柜的氣流走向。離心管、離心轉(zhuǎn)頭、或適配器加蓋密封對防止污染，防止氣溶膠擴(kuò)散有效。離心腔內(nèi)的毒害性氣溶膠會影響實驗人員的健康。
l 慢加速和慢減速：為了保證梯度的順利轉(zhuǎn)換，各類密度梯度離心要求離心機(jī)有五檔以上的慢加速（0～1000rpm）和五檔以上慢減速門（1000rpm～0）。一般的知識是這種慢加、減速速率的調(diào)整適用于固定角式，近垂直（小角度），垂直管和區(qū)帶、連續(xù)流轉(zhuǎn)頭，實際上對于直徑稍大的離心管（如直徑大于1cm 的離心管）在低速時（800rpm 左右）由于復(fù)合向心力的作用（Coriolis 力），快加速、快減速都會加大這個力的影響，從而影響密度梯度的轉(zhuǎn)換，增寬純樣品區(qū)帶寬度。而直徑1cm 的離心管容量在0.5ml 以卜，常用的離心管都會因直徑較大而受到復(fù)合向心力的影響。所以，所有的離心管直徑較大的轉(zhuǎn)頭（包括甩平轉(zhuǎn)頭）對于要求較高的密度梯度離心都要選擇適度的慢加速、慢減速。
l 預(yù)置轉(zhuǎn)速避開離心機(jī)的共振區(qū)：每臺離心機(jī)都有自己的自振頻率，這個自振頻率對不同轉(zhuǎn)頭各有差別。由于離心機(jī)減震技術(shù)的逐步完善，新機(jī)型在共振區(qū)（運轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速與自振頻率相同時）的整機(jī)振動感覺已較老機(jī)型明顯減少，但如果我們把手放在離心機(jī)臺面上或用耳貼在臺面上在加減速過程中轉(zhuǎn)速通過共振區(qū)時還是可以感覺到振動或聲音的明顯區(qū)別，尤其是對于較大容量轉(zhuǎn)頭或甩平轉(zhuǎn)頭，這種感覺更明顯。一般離心機(jī)都有幾個共振頻率，設(shè)計者往往想通過結(jié)構(gòu)設(shè)計和減震器選擇把第一（低速）共振區(qū)盡可能降低而把第二或第三共振區(qū)提高到高于最高轉(zhuǎn)速，但對于轉(zhuǎn)速范圍跨度很大的高速、超速離心機(jī)，要達(dá)到這個理想狀態(tài)是很困難的。在做密度梯度離心實驗時（尤其是低轉(zhuǎn)速的細(xì)胞或亞細(xì)胞構(gòu)造分離）使設(shè)定轉(zhuǎn)速高于（離心時間縮短）或低于（離心時間延長）共振轉(zhuǎn)速是必要的。對同一轉(zhuǎn)頭RCF×T(時間)或ω2t 等于常數(shù)，離心效果是一樣的。
l 如何看待允許不平衡量：新型的超速離心機(jī)由于減震系統(tǒng)的完善；驅(qū)動部由于對稱管不平衡引起的震動可在相當(dāng)程度上被吸收，使得主機(jī)機(jī)架幾乎感覺不到不平衡引起的震動，而驅(qū)動部壽命也會提高。對稱管不平衡要求也由用天平稱重降低到肉眼觀察液面差在5mm 以內(nèi)就可以進(jìn)行正常的離心操作。但由于開口管和密封管（溶封管，指壓管，快封管）都要求基本加滿，這個條件沒有意義。對甩平轉(zhuǎn)頭，液面距管口必須保持3mm 空間；這個條件也沒有意義。對于厚壁管和離心瓶，這個被放松的條件才有實行的可能。實驗結(jié)果表明在優(yōu)良平衡條件下進(jìn)行密度梯度離心往往有更好的離心效果，操作者可以感覺到在肉眼觀察液面差5mm 運轉(zhuǎn)條件和更精確的平衡條件下，在通過共振區(qū)（主要是低速）時機(jī)組振動感覺的差異。
l 梯度材料的純度；一般認(rèn)為分析純的梯度材料和緩沖液可用于梯度離心，但是問題出在最常用的梯度材料一蔗糖。某些所謂高純度蔗糖也含有原料植物蛋白和酶甚至還含有金屬離子和其他紫外吸收物質(zhì)。我們可以用活性碳來去除這些什質(zhì)或者使用純度有保證的蔗糖。
參考文獻(xiàn)：
（1） Miloslav, D. Richard, H “Conditions for density gradient separations”in “Preparative Centrifugation” IRL press OXFORD University press 1992
(2) Hinton ,R.H. 等“Anal.Biochem.” Vol:56 P.270
(3) Hames, B,D 等“Preparative Centrifugations”
Appendix 4, PP 369~387 IRL press 1992
作者：余興明 電話：13764301893,
