亞細胞構(gòu)造的離心分離典型實驗

一）簡介：

用簡易的差分離心結(jié)合各種型式的密度梯度離心可以分離和純化各種亞細胞器。研究者也可以根據(jù)自己的設(shè)備情況對實驗參數(shù)做一定的改動，也可以更多地利用速率-區(qū)帶密度梯度離心或等密度離心來簡化實驗過程和提高分離純度。

二）實驗：

�。﹦驖{制備：

 鼠肝12克加入0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH7.4)共45ml用“概論”中建議的勻漿設(shè)備與方法制備成勻漿待用。

ⅱ）實驗流程：

 

該實驗流程中

沉Ⅰ：細胞核、質(zhì)膜大片段、重線粒體，少量未破碎細胞及極少量沉Ⅱ→沉Ⅳ的成分。

沉Ⅱ：重線粒體、質(zhì)膜片段，及少量沉Ⅲ→沉Ⅳ成分。

沉Ⅲ：線粒體、溶酶體，高爾基膜，部分粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及極少量沉Ⅱ→沉Ⅳ成分。

沉Ⅳ：所有的細胞質(zhì)可溶部分。

離心Ⅰ：低速冷凍離心機，50ml管。離Ⅱ，離Ⅲ為高速冷凍離心機8x50ml角轉(zhuǎn)頭。

離Ⅳ為超速機或高速機8x50ml角轉(zhuǎn)頭或8x12ml角轉(zhuǎn)頭

ⅱ）從沉Ⅱ中純化線粒體：

勻漿保持在200ml甘露醇，50ml蔗糖，1mM EDTA,10mM Hepes-NaOH(ph7.4)中，全部操作均應(yīng)使勻漿在冰浴中，產(chǎn)生沉Ⅱ后去除上清表面以及離心管壁部的脂肪（這一點很重要）。

加20ml保持液到沉Ⅱ中稀釋到30ml，3000gx10分再次離心并重復(fù)以上過程二次以上，最后的沉淀保持在10ml保持液中。

ⅲ）從沉Ⅳ中部分純化光滑微粒體：

保持液為0.25M蔗糖，5mM Tris-Hcl(ph7.4)沉淀中光滑微粒體成松軟狀態(tài)位于緊密狀態(tài)的粗糙微粒體沉淀之上。

小心地倒掉上清Ⅳ后，在沉Ⅳ中加入2-3ml保持液，輕搖，大部分光滑微粒體（沉ⅣA）將分散到清液中，而沉Ⅳ（B）（粗糙微粒體，緊密沉淀）仍在沉降中，倒出沉沉Ⅳ（A），余下的沉Ⅳ（B）加入2-3ml保持液即完成。

ⅲ）從沉Ⅰ中部分純化質(zhì)膜：

保持液用  1mM NaHCO₃

鼠肝加25ml保持液在研缽中錘擊15次，仍用1mM NaHCO₃稀釋到100ml，攪拌2分鐘并用孔徑為75µm的尼龍布過濾。然后離心得到Ⅰ加5ml 1mM NaHCO₃到沉Ⅰ中再放入勻漿器，慢速往復(fù)2-3次，再用1mM NaHCO₃稀釋到15ml，用甩平轉(zhuǎn)頭10ml玻璃錐形管，1200g離心10分鐘，不用制動減速到停止，沉淀很明顯由三層組成。輕輕搖動或攪動即可使最上層的線粒體溶入上清液，中間層富含質(zhì)膜，最下層是細胞核。倒去上清加入5ml 1mM NaHCO₃輕搖使中間層進入溶液，注意要盡可能少地擾動下層核沉淀。將再次倒出的上清液稀釋到15ml并重復(fù)以上離心過程即可進一步純化質(zhì)膜。

ⅳ）從上Ⅲ中分離粗糙和光滑微粒體：

從已經(jīng)去掉線粒體的上Ⅲ中可以比從沉Ⅳ中更有效地分離粗糙及光滑微粒體，配置溶液

0.6M 蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)

15mM CSCL,1.3M蔗糖，0.25M蔗糖

用角式轉(zhuǎn)頭，10-13ml厚壁PC（聚碳酸酯）離心管，先注入3ml1.3M蔗糖5mM Tris-HCL，再注入1.5ml0.6M蔗糖，5mM Tris-HCL從而形成了一個在離心管下部的階梯形密度梯度。在梯度上部注入上Ⅲ直至充滿離心管，100000gx90分鐘。離心后得到二個主要部分，在0.6M蔗糖界面處或稍下一點是光滑微粒體，沉淀是粗糙微粒體。

用針筒吸出光滑微粒體。沉淀用三倍容積的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋后再次離心160000gx30分，得到粗糙微粒體沉淀，再用2-3ml的0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋即可。

ⅴ）從勻漿中純化細胞核：

配置溶液：0.25M蔗糖在TKM(0.05M Tris-HCL PH7.5)中及2.3M蔗糖在TKM中，25mM KCL 5mM MgCl₂

將鼠肝放在研缽中加0.25M蔗糖-TKM，沖研10- 15次，用紗布過濾后加入二倍容積的2.3M蔗糖-TKM，這樣就使蔗糖的濃度為1.62M(該濃度最好用光折射儀檢測確認，5℃折射率1.4115,20℃時，1.4137)。

將此溶液9ml注入PC離心管，在溶液下部注入3-4ml2.3M蔗糖-TKM，130000gx30分，5℃，甩平轉(zhuǎn)頭。

離心后倒去上清液即為核沉淀。它可以根據(jù)研究者需要用合適的緩沖劑稀釋。

ⅵ）從沉Ⅰ中純化細胞核：

取沉Ⅰ，用旋渦混合器分散沉淀并加入等容積的60%（W/W）蔗糖-TKM，放入勻漿器上下抽動2-3次，繼續(xù)加入60%（W/W）蔗糖-TKM直至蔗糖濃度達到55%（W/W）。用折射儀檢測（5℃折射率1.4356,20℃時，1.4328）。取該溶液9ml移入14mlPC離心管，管下部鋪3-4ml60%（W/W）蔗糖液，在甩平轉(zhuǎn)頭中120000g 5℃離心30分鐘，倒去上清液。余下的核沉淀可用合適的緩沖液稀釋。為了消除沉淀中的膜，在制備勻漿時可用0.5% Triton x-100清洗。這種做法既消除了膜，又不影響核的結(jié)構(gòu)。

ⅶ）從沉Ⅰ中純化質(zhì)膜：

配置溶液：60%（W/W）蔗糖液，37.2%（W/W）蔗糖液均分別加在5mM Tris-HCL(PH8.0)中將已制備好的沉Ⅰ剩余的緩沖液一起用渦旋混合器混合后再加入60%（W/W）蔗糖使蔗糖終濃度為48%，并用折射儀檢測（5℃折射率1.4181,20℃時，1.4150）。取以上溶液6ml注入14mlPC離心管，上鋪6ml37.2%（W/W）蔗糖液以1ml PH7.4緩沖液。在甩平轉(zhuǎn)頭中160000g，5℃，離心3小時。

質(zhì)膜聚集在37.2%（W/W）蔗糖液的上部，用注射器吸出，并用三倍容積的5mM Tris-HCL

(PH8.0)稀釋后再在100000g，5℃，離心40分鐘，沉淀即為質(zhì)膜。

ⅷ）從沉Ⅰ中純化重線粒體：

配置溶液：0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.6),1mM EDTA,1mM MgCl₂,2.4M蔗糖，將沉Ⅰ用0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5),1mM MgCl₂ 稀釋到15ml。要盡可能避免動及沉淀最底部的紅色部分。將已稀釋部分倒出，混勻后加入23ml 2.4M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5),1mM MgCl₂，所得到的最終蔗糖濃度為1.0 M。

用光折射儀測定（5℃折射率1.3827,20℃時，1.3812）如需要，進行調(diào)節(jié)，將此液體倒入一個50mlPC管，上鋪8ml0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)在35000g，5℃離心10分鐘，倒去上清液并擦凈沾在離心管壁上的物質(zhì)。沉淀很清楚有二層，順離心管內(nèi)壁加入10ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)，1mM EDTA，輕輕晃動并稀釋沉淀的上部褐色重線粒體層。

對于其他組織材料的線粒體細化問題。請參照“Methods in Enzynology”第55卷。

ⅸ）從沉Ⅲ中純化溶酶體及粒體：

配置溶液：0.3M，1.1M,2.1M蔗糖的線性梯度可以用梯度形成儀做成，也可以用不連續(xù)梯度（1.1M,1.4M,1.7M,2.1M,每種2.5ml）在5℃靜置12-16小時也會形成連續(xù)的1.1M-2.1M近線性梯度。

在沉Ⅲ中加入10ml，0.3M蔗糖，輕搖，慢慢得可以看到離心管底部沉積了暗褐色的沉淀（溶酶體）倒去上清，加入4ml0.3M蔗糖液在勻漿器中磨勻（注意：活塞與器壁要松一些）。取2ml以上勻漿置于線性梯度（1.1M-2.1M蔗糖）之上，輕攪勻漿使其與梯度液之間的界面盡可能減少密度的不連續(xù)，在甩平轉(zhuǎn)頭中95000g，5℃離心4小時。

離心后，溶酶體區(qū)帶形成于1.20-1.26g/cm³密度之間（在離心管下部），而線粒體則形成于1.17-1.21g/cm³密度之間（在離心管中部。溶酶體區(qū)帶中密度較高的部分相對較純。）

ⅹ）從沉Ⅱ及沉Ⅲ中純化高爾基膜：

配置梯度溶液：38.7%，36%，33%，29%（W/W）蔗糖液每種均加入5 mM Tris-HCL(PH8.0)

用上清Ⅰ離心，10000g，5℃ 20分鐘得到沉Ⅱ+沉Ⅲ

用5ml 0.25M蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋沉淀，恒溫攪拌并使溶液的蔗糖濃度上升到43.07%（W/W），用光折射儀檢測（5℃折射率1.1979,20℃時，1.1957）

在PC離心管中（13ml）由下往上依次鋪設(shè)如下層次：

3ml樣品（蔗糖濃度43%w/w），4ml 38.7%蔗糖液，2ml 36%蔗糖液，2ml 37%蔗糖液，2ml 29%蔗糖液，在甩平轉(zhuǎn)頭中100000g，5℃離心1小時，用注射器收集含有高爾基膜的上部二個區(qū)帶。

我們也可以用這個方法從全勻漿中來分離純化高爾基膜，勻漿中蔗糖濃度配到43.7%，然后用以上不連續(xù)梯度來分離純化，但是對于大容量勻漿，直接法是不合適的。

小結(jié)：以上典型實驗以鼠肝勻漿為原料，以差分離心為主，輔以蔗糖的連續(xù)或不連續(xù)梯度分離各種亞細胞器，方法簡單易行，成本也較低。我們也可以用Ficoll,percoll,Metrizamid, Nycodenz,……等等梯度材料來分離純化亞細胞器。

 

作者：余興明   電話：13764301893,