亞細(xì)胞構(gòu)造的離心分離概論
瀏覽次數(shù):3689 發(fā)布日期:2005-3-10
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現(xiàn)代生物學(xué)研究常常需要提取和純化細(xì)胞及組織中的亞細(xì)胞構(gòu)造(細(xì)胞核、質(zhì)膜、內(nèi)笪綱、高爾基體、線粒體、溶酶體、微粒體等等)。在經(jīng)過選擇的最合適的生物體勻漿制備后,用離心法提取和純化亞細(xì)胞構(gòu)造是最常用、也是最有效的實(shí)驗(yàn)手段。
(一)勻漿制備:
將生物體組織剪切成2~3毫米小塊或小片,以每100毫升加濕重5~10克配置組織液,即可用下列各種勻漿設(shè)備制備勻漿。
。╥)帖床式勻漿機(jī):
最常用,可調(diào)速,磨頭可手操作升降的實(shí)驗(yàn)室勻漿機(jī)。
常用聚四氟乙烯園柱型帶球形頂端的磨頭。定制的硬質(zhì)玻璃容器,磨頭在玻璃容器中既旋轉(zhuǎn)又上下移動(dòng)。磨頭與容器間隙可根據(jù)需要調(diào)整在0.05~0.15毫米之間。
制備某些大溫度敏感的材料,容器可固定在一個(gè)封閉園筒中,園筒通以冷卻水,避免勻漿制備過程中這樣品溫度升高。冷卻水可用自來水也可以用低溫循環(huán)水槽的外循環(huán)冷卻水。
這種勻漿機(jī)最常用于"軟"組織(腦、肝等)的勻漿制備,常用將速在1500轉(zhuǎn)/分以下,磨頭上下升降5~15次。
(ii)剪切型勻漿機(jī)。
轉(zhuǎn)頭分為硬度、可產(chǎn)生相對(duì)剪切運(yùn)動(dòng)的多刀刃刀片,轉(zhuǎn)速較高(10000轉(zhuǎn)/分)下,可調(diào)。適用于較"硬"組織(肌肉,心肌,內(nèi)臟等等)的勻漿制備。
(iii)高壓 氣體破碎法(主要是N2):20~100大氣壓,10~60分鐘也可以制備勻漿。
(iv)超聲波破碎機(jī):可產(chǎn)生很高的液體剪切力。但對(duì)生物大分子(DNA,RNA等)有破壞作用,常用于只研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的勻漿制備。
。╲)大量樣品用的制備型工業(yè)勻漿泵:綜合利用機(jī)械剪切與細(xì)胞真空炸裂原理制造的高效勻漿(均質(zhì))設(shè)備用于生產(chǎn)型勻漿制備。
(二)過濾:根據(jù)樣品的實(shí)際情況,在勻漿制備前或會(huì),為了濾去某些不得不 破碎的組織顆粒,可用優(yōu)質(zhì)棉布或尼龍布(單層或多層)過濾樣品。
(三)供參考的初步離心法:
(四)亞細(xì)胞構(gòu)造的進(jìn)一步純化:
(i)溶劑:為了避免質(zhì)膜及其他亞細(xì)胞器的損傷,保證在離心過程中組織不變性,常用的溶劑有1mM EDTA, 0.1~1mM PMSF, 5~10mM Tris或Hepes等等,具體配置請(qǐng)參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
(ii)差分法:經(jīng)過多次繁復(fù)的差分離心分離也可以純化各種亞細(xì)胞器,但常常是事倍功率:很大的離心工作量,得到不太高的純度。由于離心技術(shù)的進(jìn)展,目前已少用,本文不作介紹。(如果有人感興趣,可與作者聯(lián)系)
(iii)密度梯度離心法:(略,詳見參考文獻(xiàn))
① 各種亞細(xì)胞構(gòu)造的沉降系數(shù)范圍:
細(xì)胞核:5×106~8×106
質(zhì)膜(大片):105~6×105
質(zhì)膜(小片):5×101~5×103
內(nèi)質(zhì)綱片斷:101~103
溶酶體,線粒體:2×103~8×103
②各種亞細(xì)胞器的尺寸及其在典型梯度材料中的浮密度:
名稱 |
尺寸 |
密度 |
(µ m) |
蔗糖中 |
Ficoll |
Percoll |
Metrizamid |
Nycodenz |
核 |
3~12 |
>1.3 |
/ |
1.09 |
1.22 |
1.23 |
線粒體 |
0.5~2 |
1.19 |
1.14 |
1.10 |
1.16 |
1.17 |
溶酶體 |
0.5~0.8 |
1.21 |
/ |
1.06 |
1.13 |
1.15 |
質(zhì)膜(大片)小顆粒 |
3~20 |
1.16~1.18 |
~1.05 |
~1.03 |
1.14~1.26 |
1.11~1.19 |
0.05~3 |
1.13 |
內(nèi)質(zhì)網(wǎng) |
0.05~0.3 |
1.06~1.23 |
/ |
/ |
/ |
/ |
③推薦的離心參數(shù)
方法
名稱 |
差分沉降在0.25M蔗糖液中 |
速率—區(qū)帶密度梯度離心5~20g蔗糖液中5℃ |
等密度離心(ISOPYCNIC)(同左或其他合適介質(zhì)中) |
核 |
1000g×10分鐘 |
500g×10分鐘 |
4000g×60分鐘 |
線粒體 |
10000g×20分鐘 |
5000g×10分鐘 |
80000g×100分鐘 |
溶酶體 |
10000g×20分鐘 |
5000g×10分鐘 |
80000g×100分鐘 |
內(nèi)質(zhì)網(wǎng) |
150000g×40分鐘 |
10000g×20分鐘 |
100000g×200分鐘 |
微粒體 |
100000g×60分鐘 |
10000g×30分鐘 |
10000g×360分鐘 |
質(zhì)膜大片 |
10000g×15分鐘 |
~100000g×100分鐘 |
~150000g×600分鐘 |
(小顆粒) |
100000g×60分鐘 |
作者:余興明 電話:13764301893,