一、實驗試劑
1、培養(yǎng)基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S
4、染色液: 0.4% Trypan Blue
5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑:肌動蛋白、a-SMA或Desmin抗體,熒光標(biāo)記二抗,4%多聚甲醛
二、實驗器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、玻璃滴管
6、燒杯
7、15ml離心管
三、實驗流程
成年大鼠,麻醉,無菌獲取主動脈血管
↓
1 × PBS (pH 7.4 )洗滌血管,剝?nèi)パ芡饽ね飧街慕M織
↓
縱向剪開血管,內(nèi)膜向上,用鈍鑷子橫向刮動血管內(nèi)膜,去掉內(nèi)皮細(xì)胞,用1 × PBS (pH 7.4 )反復(fù)洗滌。
↓
用鑷子橫向刮動血管,刮下來中膜層,收集中膜用PBS洗滌,加入少量培養(yǎng)基(PriCells),將血管剪切為1×1mm3的小塊,1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次
↓
組織塊中加入消化液(PriCells),轉(zhuǎn)至15ml離心管中于37℃水浴恒溫消化15min,間隔2-3min搖動,靜置1min,收集消化液,重復(fù)消化3-4次。
↓
收集消化液,加入消化終止液(PriCells)終止反應(yīng)
↓
離心,1000rmp,10min,棄去上清
↓
重懸,計數(shù)細(xì)胞
↓
接種密度以5 × 105個/ml
↓
培養(yǎng)37℃,5%CO2
四、實驗操作
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶,置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干(切記保持無菌),4℃冰箱放置,備用。
2、取材:正常成年大鼠腹腔注射5%苯巴比妥麻醉,75%酒精浸泡,無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。
3、材料預(yù)處理:將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS (pH 7.4 )中反復(fù)洗滌,去除血管外部的血漬,洗滌液澄清,用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。
4、除去內(nèi)皮細(xì)胞:將血管縱向剪開, 內(nèi)膜面向上,無菌鑷子沿中軸方向反復(fù)刮動內(nèi)膜層4-5遍,去掉內(nèi)皮細(xì)胞,用1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次。
5、分離中膜:將去掉內(nèi)膜的血管,繼續(xù)刮動分離中膜,去掉外膜,用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊,加入1 × PBS (pH 7.4 ),轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中,PBS洗滌3次,離心收集沉淀物。
6、消化:在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液,將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化:吸出消化液入新的離心管中,按1:1加入消化終止液,中止酶反應(yīng);余下的組織繼續(xù)加入消化液,消化15min ,重復(fù)消化3次。
8、收集重懸細(xì)胞:收集中止后的消化液于離心管中,1000 rpm,離心10 min,棄去上清,加入培養(yǎng)液重懸,染色計數(shù)細(xì)胞。
9、培養(yǎng)細(xì)胞密度:調(diào)整細(xì)胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
10、培養(yǎng):放置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。
五、細(xì)胞鑒定
1、顯微鑒定:相差顯微鏡下,可見細(xì)胞呈長梭狀,具備良好的透光性。細(xì)胞之間呈現(xiàn)典型的波峰波谷樣生長,有接觸抑制的特點。
2、免疫組織化學(xué)鑒定 :利用肌動蛋白、a-SMA或Desmin免疫熒光染色鑒別平滑肌細(xì)胞。
1) 細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中,接種細(xì)胞為3×104個/孔,48小時候細(xì)胞可以長滿,用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
2) 細(xì)胞固定:用1 × PBS (pH 7.4 )洗滌細(xì)胞,之后放入4%多聚甲醛中,固定10min,空氣中自然干燥。
3) 特異性抗體:按照說明書稀釋比要求稀釋抗體,加入抗體,放置37℃孵育60min。
4) 洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。
5) 標(biāo)記性抗體:加入熒光標(biāo)記抗體,37℃孵育30min。
6) 洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。
7) 封片:封片劑封片。
8) 鏡檢:熒光顯微鏡下觀察,平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)棕紅色熒光。
六、注意事項
1、為了保持細(xì)胞活力,大鼠適宜采用藥物麻醉后取材。大鼠應(yīng)嚴(yán)格消毒,無菌解剖,打開胸腔后換取另一套器械獲取主動脈血管。
2、注意盡可能洗滌凈血管內(nèi)的殘血,避免血細(xì)胞及某些血清成分對細(xì)胞貼壁的影響。
3、血管由內(nèi)膜層,中膜層和外膜層三層膜結(jié)構(gòu)構(gòu)成,而血管平滑肌細(xì)胞主要分布在血管中膜層,采用機(jī)械刮除法去掉內(nèi)膜后再獲取中膜以分離細(xì)胞,從血管內(nèi)膜面刮下的細(xì)胞可以收集計數(shù),培養(yǎng)主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。
4、酶消化法分離血管平滑肌細(xì)胞,酶消化過度容易損傷細(xì)胞,影響平滑肌細(xì)胞的貼壁,因此消化過程中應(yīng)針對所分離的細(xì)胞源組織的構(gòu)成,選擇適宜的酶,并嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
5、嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液(培養(yǎng)基,生長因子,血清,抗生素)的質(zhì)量,濃度。
6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個(25 cm2培養(yǎng)瓶),細(xì)胞倍增時間為48小時。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代, 傳代次數(shù)增加,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞間易相互融合,界限不明朗,細(xì)胞貼壁牢固,傳代消化時間會有所延長。
七、細(xì)胞圖片