全自動核酸分子診斷系統(tǒng)的某些進(jìn)展

        劉賓 覃斌兵 劉洪娜 何農(nóng)躍

(東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇南京210096)

 

摘 要 隨著后基因組時(shí)代的到來，全自動核酸分子診斷系統(tǒng)得到了廣泛的應(yīng)用。本文立足于國內(nèi)外醫(yī)療儀器市場全自動核酸分子診斷系統(tǒng)的現(xiàn)狀，介紹了全自動核酸分子診斷系統(tǒng)的基本組成及其關(guān)健技術(shù)。在此基礎(chǔ)上介紹了國際上全自動分子診斷系統(tǒng)的主要生產(chǎn)商及其產(chǎn)品，并對具有代表性的幾個(gè)產(chǎn)品的特點(diǎn)進(jìn)行了分析。最后對全自動核酸分子診斷系統(tǒng)的發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)健詞 全自動;高通量;分子診斷;單核苷酸多態(tài)性

 

Liu Bin, Qin Binbing, Liu Hongna, He Nongyue

(Southeast University, State Key Laboratory of Bioelectronics, Nanjing Jiangsu, 210096)

Abstact With the post-genome era coming, fully automated nucleic acid molecular diagnostic system has been used widely. In view of existing situation of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system in medical apparatus and instument market, the principle of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is introduced.The characters of representative products are analyzed. At last, the development of fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is prospected.

Key words  Fully automatic; High throughput;Molecular diagnostics; SNPs

 

分子診斷是指利用核酸或蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記進(jìn)行臨床檢測的診斷技術(shù)，為疾病的預(yù)測、診斷、預(yù)防、治療和轉(zhuǎn)歸提供了信息和決策依據(jù)。特別是面對各種突發(fā)性傳染性疾病，其最經(jīng)濟(jì)有效的措施就是快速、準(zhǔn)確的分子診斷。分子診斷的發(fā)展很大程度上受分子診斷儀器自動化的影響。人類基因組計(jì)劃的完成，日臻完首的分子診斷方法，使得分子診斷自動化得到了進(jìn)一步的發(fā)展。

全自動分子診斷系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)多樣本，多位點(diǎn)的快速的高通量檢測，它不儀能夠?qū)⒀芯咳藛T從實(shí)驗(yàn)臺邊上解放出來，滿足人們對大量生命信息進(jìn)行分析的要求、大大加快實(shí)驗(yàn)和研究進(jìn)程，而且具有適合臨床應(yīng)用的檢側(cè)方法，因此在實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

    以基于磁分離的全自動分子診斷系統(tǒng)為例，其基本功能框圖如圖1所示。

    大多數(shù)全自動分子診斷系統(tǒng)包括以下幾個(gè)功能模塊:樣本提取、樣本處理、高通量樣本檢測與分析等。其硬件系統(tǒng)一般包括:精確移液模塊、機(jī)械抓板臂、精確溫控模塊、信號檢測模塊等。

全自動分子診斷系統(tǒng)能夠完成“樣本制備一靶分子富集或擴(kuò)增一信號檢測一數(shù)據(jù)分析”的生物分子檢測分析的全過程自動化。其中涉及到的關(guān)鍵技術(shù)包括基于功能性磁性納米顆粒（Functional Magnetic Nanoparicles, FMNPs）的樣本提取與處理技術(shù)、生物靶分子的獲取與放大技術(shù)、高通量信號檢測技術(shù)等。

     1997年，Hawkings等提出了基于磁性納米顆粒分離和富集功能的DNA提取技術(shù)^[3] 。磁性納米顆粒提取是一個(gè)簡單、快速、有效的DNA分離方法，整個(gè)操作過程無需離心或柱分離。無需使用有機(jī)溶劑及其它有毒試劑，可實(shí)現(xiàn)高通量自動化操作，特別適用干全自動工作站。2006年，Berensmeie等將傳統(tǒng)的 DNA提取方法和基于磁性納米顆粒的提取方法進(jìn)行了比較^[4]，指出采用磁性納米顆粒提取模板DNA，可以去除許多影響后續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）的雜質(zhì)，提高PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性。此外，一定量的磁性納米顆�？梢晕�附一定量的DNA，有助于獲得相對恒量的模板DNA。Thermo Scientific公司提出的Kingfisher專利技術(shù)通過磁棒轉(zhuǎn)移磁珠從而轉(zhuǎn)移樣品，避免了DNA提取過程中繁瑣的液體處理過程，使得平行的純化樣品的高通量化成為可能。

 PCR反應(yīng)通常在均一的溶液中進(jìn)行，而在納米顆粒表面實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增已成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。2000年，Adessi和Huber等人提出了基于固相的PCR技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上研究了玻璃表面的PCR,探討了研制相應(yīng)DNA芯片的可能性^[5]；2007年，Lermo等人研究了基于磁性納米顆粒表面的PCR，并用電化學(xué)的方法檢測食物中的病原休^[6]。

     此外，已經(jīng)有國外研究者利用磁性納米顆粒進(jìn)行基因突變點(diǎn)檢測。 2003年，東京農(nóng)業(yè)大學(xué)Matsunaga教授及其研究小組首先制備了親和素修飾的細(xì)菌磁性納米顆粒（Bacteria magnetic particles, BMP）,然后利用BMP發(fā)展了一系列的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNPs分型方法，同時(shí)還發(fā)展了一套基于96孔板的自動操作系統(tǒng)，但是這些檢測方法相對比較耗時(shí)，且不易實(shí)現(xiàn)高通量化。2005年，Kakihara及其研究小組利用磁性納米顆粒作為反應(yīng)載體固定生物素標(biāo)記的延伸引物，與純化的PCR產(chǎn)物退火后，延伸上標(biāo)記有堿性磷酸酶的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP），最后通過化學(xué)發(fā)光方法檢測SNPs^[8]。該方法能夠準(zhǔn)確對樣本進(jìn)行分型，但分型前首先需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的純化濃縮，操作過程相對復(fù)雜。

     2007年，劉洪娜等利用磁性納米顆粒PCR擴(kuò)增(MNPs-PCR)和等位基囚特異性雙色熒光探針(Cy3，Cys)雜交技術(shù)，建立了一種單核昔酸多態(tài)性分型的新方法^[9]。此方法無須產(chǎn)物純化、濃縮，掃描分型結(jié)果快速、直觀，是一種操作簡單、快速，高通量、高靈敏度的分型方法，而且容易實(shí)現(xiàn)自動化。2008年，劉洪娜等提出了一種應(yīng)用磁性顆粒和通用連接子擴(kuò)增技術(shù)(Adaptor-PCR)的多位點(diǎn)SNP分型方法^[10]。通過連接子PCR擴(kuò)增樣本的全基因組產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了對多個(gè)樣本多個(gè)SNP位點(diǎn)的同時(shí)檢測，避免了復(fù)雜的多重引物擴(kuò)增。該方法能夠在短時(shí)間內(nèi)完成對大量樣本的多個(gè)位點(diǎn)分型，且分型結(jié)果直觀，誰確，正錯配信一號比值高(>3 .0)。

     2009年，何農(nóng)躍等提出的基干磁性納米顆粒的PCR擴(kuò)增和雙色熒光通用標(biāo)簽的高通量SNP分型技術(shù)被作為一種通用的分子生物學(xué)方法編入了Methods in Molecular Biology系列叢書中。同年，課題組提出了一種基于磁分離的單堿基循環(huán)延伸的點(diǎn)突變檢測方法^[12]。該方法以磁性納來顆粒作為載體，在其上進(jìn)行.單堿基循環(huán)延伸，實(shí)現(xiàn)對樣品的準(zhǔn)確分型。此方法的最大優(yōu)點(diǎn)是避免了由于錯配探針雜交產(chǎn)生的假陽性信號，因此共有極高的誰確性口同時(shí)。循環(huán)延伸所用靶序列為基因組DNA而作傳統(tǒng)單堿基延伸法中所用的經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物，因而反應(yīng)步驟大大簡化且非常容易實(shí)現(xiàn)自動化操作。

 

      自從1980年，第一臺臨床自動化樣本處理裝置被投入使用以來，越來越多的實(shí)驗(yàn)室自動化裝置被設(shè)計(jì)、生產(chǎn)，投入使用。全自動裝置由于具有智能、快速、準(zhǔn)確以及不知疲倦的工作能力，它的使用能夠大人提高實(shí)驗(yàn)室工作效率，帶來強(qiáng)大的高通量繪測能力，將研究者從高強(qiáng)度的重復(fù)勞動中解放出來。隨著時(shí)代的發(fā)展，其檢驗(yàn)領(lǐng)域及所能涵蓋的檢測項(xiàng)目正逐漸豐富，全自動設(shè)備在臨床診斷以及治療監(jiān)測等方面也發(fā)揮出越來越重要的作用。日前全球很多公司從事全自動檢測設(shè)備的開發(fā)與研究，表1列出了一些國際知名自動化處理、檢側(cè)設(shè)備的生產(chǎn)商。

 

表1、國際上分子診斷系統(tǒng)主要廠商及產(chǎn)品

Table 1 The main corporation and products of fully automation molecule diagnostic system i

 

 

     其中比較著名的有英國的TAP(The Automation Partnership)。全球最大的實(shí)驗(yàn)室自動化系統(tǒng)供應(yīng)商之一，其產(chǎn)品分為細(xì)胞培養(yǎng)與處理系統(tǒng)、樣品管理與篩選系統(tǒng)兩大類，提供一系列細(xì)胞培養(yǎng)與檢側(cè)相關(guān)的自動化系統(tǒng)。其中的SelecT系統(tǒng)能夠提供高通量細(xì)胞培養(yǎng)和檢測樣木板制備，Piccdol系統(tǒng)能夠提供自動優(yōu)化蛋白質(zhì)樣品制備，Cello系統(tǒng)能夠自動完成高通量克隆操作，而Homebase系統(tǒng)能夠?qū)ι�物或化學(xué)樣品進(jìn)行自動化存儲與管理。

     Beckman Culter 是全球知名生命科學(xué)設(shè)備供應(yīng)商，主要產(chǎn)品為Biomok系列自動工作站系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用十基因組研究研究領(lǐng)域。其系統(tǒng)能夠完成各種樣品的DNA/RNA提取與純化、PCR反應(yīng)體系建立及產(chǎn)物純化、核酸適配子(Aptamer)篩選等實(shí)驗(yàn)。該系列產(chǎn)品在自動操作方而功能較強(qiáng)，操作精確度高，用戶界面友好，操作方便，因而具有較高的市場占有率。

     世界知名分子診斷公司羅氏，開發(fā)出COBAS AMPLICORRTM Analyzer全自動PCR診斷系統(tǒng)，它將熱循環(huán)、自動化加樣、孵育、清洗與光密度測量五種儀器組合在一起，在同一儀器上實(shí)現(xiàn)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增與檢側(cè)步驟的自動化，可用于病原體的定性或定量檢測等。

     我國全白動分子診斷設(shè)備的開發(fā)僅處于剛起步階段，市場上很少有國產(chǎn)成熟的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的集樣本處理與分析于一體的實(shí)驗(yàn)室白動化設(shè)備。國內(nèi)所使用的自動化設(shè)備基本為進(jìn)口產(chǎn)品，固定的設(shè)備(生產(chǎn)線、儀器設(shè)查)，缺乏靈活性，使得進(jìn)口儀器往往不太適應(yīng)中國國情，不適用于國內(nèi)一般醫(yī)院，從而大大限制獷自動化裝置在我國的普及。

     縱觀當(dāng)前全自動分子診斷設(shè)備的發(fā)展趨勢，最為突出的關(guān)瀚概念是“統(tǒng)一化’、“集成化”以及“微型化”。

   “統(tǒng)一化”是指全自動分子診斷設(shè)備中應(yīng)當(dāng)確立一個(gè)統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。從2000年起，美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)淮委員會National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)和國際臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)淮委員會（International Committee for Clinical Laboratory Standards, ICCLS)合作一直致力于制定全自動分子診斷設(shè)備統(tǒng)一的標(biāo)誰^[13]。因此，在未來的自動化設(shè)備研制中，可以優(yōu)先考慮“先軟后硬”設(shè)計(jì)方法，首先要建立功能強(qiáng)大、且能夠升級的分子診斷策略，然后根據(jù)確立的檢側(cè)策略設(shè)計(jì)與之配套的硬件，這樣建立的自動化檢測平臺不但能大大降低儀器開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，而且將來產(chǎn)品推向市場不會存在無配套產(chǎn)品的市場風(fēng)險(xiǎn)。

    “集成化”是指將各種先進(jìn)分析儀器模塊化后集成到一個(gè)系統(tǒng)中。隨著對生物大分子分析、檢濺自動化需求的日趨強(qiáng)烈，對自動化設(shè)備的功能也提出了新的要求，自動化設(shè)備需要能夠?qū)�樣本存貯、樣本制備、分析反應(yīng)二信號檢測和分析等功能集成，將各種不同的功能模塊優(yōu)化整合在一起�！凹�成化’并不是將各種滾先進(jìn)的儀器模塊堆砌在一起，而是根據(jù)希望實(shí)現(xiàn)的目的，選擇合適的檢側(cè)方法與檢測器，合適的液體轉(zhuǎn)移方式，合適的質(zhì)量控制模式，優(yōu)化選擇、組合集成，以期能夠?qū)�檢測方法在儀器上完美實(shí)現(xiàn)。

   “微型化’是指將全自動分子診斷系統(tǒng)小型化以適應(yīng)個(gè)體化醫(yī)療的要求，以應(yīng)用于家庭、小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)以及即時(shí)診等�！拔⑿突�”并不是將功能簡化，而是利用先進(jìn)的微電子、微流控芯片等技術(shù)，使全自動分子診斷設(shè)備的體積進(jìn)一步縮小，以滿足不同群體的需求。

    當(dāng)前，國內(nèi)的醫(yī)療器械研究機(jī)構(gòu)應(yīng)盡快開展關(guān)干全自動分予診斷儀器的研究，解決其中關(guān)鍵向題，研制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的全自動分子診斷系統(tǒng)，打破國外高端分子診斷系統(tǒng)在國內(nèi)的壟斷地位，從而填補(bǔ)國內(nèi)在這一領(lǐng)域的空白。