ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)提供了擴(kuò)展批處理肽譜圖分離的精確性和重現(xiàn)性。

目標(biāo)

測定 ACQUITY UPLC ® H-Class 系統(tǒng)在長淺洗脫梯度應(yīng)用中的分析可重現(xiàn)性，以解析復(fù)雜的混合物，例如肽圖譜分析。

背景

肽譜分析用于確認(rèn)某種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，識別翻譯后修飾（ PTM ），并分析潛在的雜質(zhì)。任何蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異應(yīng)反映在含有該修飾的肽保留時(shí)間的變化中。含有和不含有特殊修飾的肽段的相對數(shù)量被用于測定含有該修飾的特定樣品中的蛋白質(zhì)的比例或含量。

面積比例的變化對應(yīng)于含有特定修飾的樣品中的蛋白分子的含量。為滿足這些應(yīng)用要求，需要采用長淺梯度洗脫。過去這些分離條件對于單泵梯度系統(tǒng)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。本研究中，我們在 ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)上測試了一種典型的肽譜分析方案。

圖 1. 肽段作圖樣品列表開始于星期五，并在整個(gè)周末自動運(yùn)行在星期一工作人員回到工作崗位時(shí)，數(shù)據(jù)已經(jīng)準(zhǔn)備好接受復(fù)查。圖中顯示了每三項(xiàng)分離，表現(xiàn)出了優(yōu)異的重現(xiàn)性，分辨率和保留時(shí)間。如同表格 1 中的概括，五個(gè)做標(biāo)記的峰，從 A 到 E ，被選為定量分析的代表。

溶液

ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)由四元溶劑管理器（ QSM ），流量通過針頭樣品管理器（ SM-FTN ），柱加熱器，以及光電二極管陣列（ PDA ）檢測器。安裝了可選擇的 250μL 混合器。 MassPREP TM BSA 試劑中的標(biāo)準(zhǔn)肽段溶液經(jīng)過 ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 反相柱分離。當(dāng)每增加一個(gè)床體積的洗脫體積，洗脫梯度增加 1.0% ，每分鐘梯度增加約為 0.6% ，此梯度被選為典型多肽作圖梯度。

該方案充分利用了儀器的自動混合能力。純?nèi)軇﹥σ浩骱蜐饪s修飾劑儲備被用于替代二元，經(jīng)預(yù)處理的溶劑。在本例中，梯度是在線路 A 中的純水和線路 B 中的純乙腈中形成，而一部分的液流從含有 1%TFA 的水儲液器 D 中抽取。在梯度中，線路 D 的比例從 5% 降低到 4% ，相當(dāng)于 TFA 濃度從 0.05% 降低到 0.04% ，從而使得基線漂移最小化。

肽譜圖顯示于圖 1 ，表格 1 中統(tǒng)計(jì)分析了保留時(shí)間和峰面積等參數(shù)。相對保留和分辨率在長系列運(yùn)行期間保持恒定。保留時(shí)間是充分可重現(xiàn)的，以保證峰始終能被正確識別。以峰 A 的面積作為參比，比較峰 B 、 C 、 D 、和 E ，計(jì)算各測試樣中其相應(yīng)比例。在各測試樣中這些面積比例均高度一致（如表格 1 ），這樣的精度符合我們在系列樣品中測量修飾蛋白質(zhì)的比例的要求。

表格 1. 色譜峰保留時(shí)間和面積比例的總結(jié)。選作定量比較的 5 個(gè)峰，在整個(gè)洗脫梯度中均均勻間隔 10min 。

總結(jié)

對于有意義的肽段作圖，同時(shí)需要定量和定性的可重現(xiàn)性。 ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)為大樣品的肽段作圖分離提供了精準(zhǔn)的控制，使得分析師對儀器充滿信心，相信任何保留時(shí)間的偏差均說明樣品組成發(fā)生了變化，而不是由于儀器可變性引起的。在利用了這一多溶劑混合能力時(shí)，經(jīng)觀察的分離符合這一目標(biāo)。這一系統(tǒng)的設(shè)計(jì)確保定量和定性結(jié)果均符合現(xiàn)代分析生物化學(xué)的要求 .

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