(張蓓，沈立松  上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院上海兒童醫(yī)學(xué)中心實驗診斷中心)

摘要:多聚酶鏈反應(yīng)飛速的發(fā)展使其成為了分子生物學(xué)實驗室重要的工具，實時熒光定量PCR(real-timequantitative PCR)技術(shù)以其敏感性高、重復(fù)性好、速度快和污染少使PCR技術(shù)又向前邁進了一步。本文對real-timeQ-PCR技術(shù)的原理、五種主要的熒光化學(xué)及定量方法作一介紹，同時也討論了此技術(shù)存在的不足，并對其目前在研究領(lǐng)城中主要的應(yīng)用進行了概述。

多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這期間其技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來出現(xiàn)的實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，本文就此技術(shù)及其應(yīng)用做一綜述。

1實時熒光定量PCR技術(shù)的方法學(xué)

1.1原理
所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進

程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光標(biāo)記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time令PCR方法在研究工作中的運用。

 

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物，因此用此終點法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最

初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一個熒光信號的域值，一般這個域值(threshold)是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號(baseline),熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到的熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(CO.Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1.2熒光化學(xué)

目前real-timeQ-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是:DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。

擴增序列非特異性檢測方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBRgreen1[33等熒光染料。Real-timeQ-PCR發(fā)展早期就是運用這種最簡單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBRgreen1熒光染料，SYBRgreen1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設(shè)計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(meltingcurve)分析的軟件加以解決。

擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的墓因特異寡核普酸探針來檢測產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略川。目前在real-timeQ-PCR中最廣泛使用的TagMan系統(tǒng)就是運用了這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核普酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5，端熒光墓團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅墓團(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)，因此探針完整時，檢測不到該探針5'端熒光墓團發(fā)出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿摸板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5'-3'外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5'端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3，端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

 

直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光。分子信標(biāo)(molecularbeacon)['〕就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，結(jié)合在其兩端的熒光基團距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補序列出現(xiàn)時，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個開放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報告熒光基團與淬滅熒光墓團彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅墓團的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。熒光標(biāo)記引物是從分子信標(biāo)的概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團直接摻入PCR擴增產(chǎn)物中。目前主要有兩種:日出引物(sunriseprimes)和蝎子引物(scorpionprimes)。雜交探針(hybridizationprobe)使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3'端標(biāo)記有供體熒光素(donor)，而下游的探針的5‘端標(biāo)記有受體熒光素(acceptor)。在PCR中模板退火階段，兩探針同時與擴增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能f轉(zhuǎn)移(FRET，此作用與上述水解探針的方式相反)，使得受體熒光墓團發(fā)出熒光;當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時，無熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核普酸熔解曲線(meltingcurve)對與寡核普酸探針結(jié)合的序列進行分析，從中獲取有用的信息。

1.3定量方法

在real-timeQ-PCR中，模板定量有兩種策略:相對定t和絕對定。相對定t指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的f的變化。絕對定t指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的to

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定f由于在此方法中f的表達是相對于某個參照物的f而官的，因此相對定f的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實驗中樣本的靶序列的t來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的t，即參照物是1，的樣本，其它的樣本為參照物t的n倍。在實驗中為了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA或DNA的，往往在反應(yīng)中同時擴增一內(nèi)源控制物，如在墓因表達研究中，內(nèi)源控制物常為一些管家墓因(如beta-actin,3-磷酸甘油醛脫氮酶UAPDH等)。

1.3.2比較CT法的相對定量比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定t的不同之處在于其運用了數(shù)學(xué)公式來計算相對t，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)I，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反應(yīng)起始模板的量，一個循環(huán)(CT=1)的不同相當(dāng)于起始棋板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶墓因和內(nèi)源控制物的擴增效率墓本一致為前提的，效率的偏移將影響實際拷貝數(shù)的估計。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量此方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定f的不同之處在于其標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對定f標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的f可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。

2實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

Real-timeqPCR的應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核普酸多態(tài)性(SNPs)的測定等。以下就目前real-timeQ-PCR在易位墓因的檢測，細胞因子的表達分析，腫瘤耐藥墓因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測中的應(yīng)用作一概述。

 

2.1微小殘留病變的檢測腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤

常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監(jiān)測臨床治療效果的一種腫瘤標(biāo)志。雖然在過去的幾十年里治療方案的改進已大大地延長了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復(fù)發(fā)的危險性。因此微小殘留病變(MRD)的檢測對于進一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。Real-timeQ-PCR的應(yīng)用正成為檢測腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。通過對腫瘤融合基因的定量測定能指導(dǎo)臨床對病人實行個體化的治療。急性粒細胞性白血病(AML)最常見的染色體異常是交互易位t(8;21)(g22;q22)，在這易位中，AML-1轉(zhuǎn)錄因子基因和

8號染色體的MTG8基因發(fā)生融合，致使正常的AML-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到影響，這可能是白血病的病因。目前的研究[1o〕證明用real-timeqPCR來檢測融合基因有助于對這些病人的MRD進行定量，其作為預(yù)后的指標(biāo)或?qū)χ委煼桨傅脑u估是有價值的。同樣的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細胞性白血病(CML)的BCR-ABI_融合墓因〔”氣急性琳巴細胞性白血病(ALL)的白血病特異的TEL-AML1融合基因〔iz],濾泡狀琳巴瘤(Fl,)的染色體易位t(14;18)(g32;g21)[Is」和bel-2重排C14〕等。許多研究都在很大程度上受益于real-timeQ-PCR方法的應(yīng)用，隨著技術(shù)的發(fā)展，Real-timeQ-PCR的運用將不斷地擴大。

2.2細胞因子的表達分析細胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(包括琳巴細胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系統(tǒng)中起若核心作用。許多不同類型的細胞都能分泌這種低分子f的蛋白質(zhì)，其中包括琳巴細胞、抗原遞呈細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞。細胞因子可被分為不同的組:白介素(II.1-"IL-23)，干擾紊(IFN-+,IFN-Y等)，集落刺激因子(CSF),腫瘤壞死因子(TNF),腫瘤生長因子(TGF-月等)和化學(xué)因子(MCP-1,MIP-1等)[I]。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑，細胞因子

mRNA表達譜的可靠定t是很重要的。盡管被檢樣本中細胞因子含t往往極低，然而real-time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)以其高敏感性和準(zhǔn)確性在細胞因子的定f中越來越受到青睞。

2.3腫瘤耐藥薈因裹達的研究對化療藥物的耐藥是治療腫瘤病人的主要障礙。由于耐藥限制了許多腫瘤的成功治療，因此研究腫瘤細胞的耐藥機制就變得十分重要。目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的耐藥機制有:ATP結(jié)合盒墓因超家族(ATP-bindingcassettesuperfamily)的膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的耐藥[15]，這些蛋白包括:MDR-1墓因編碼的P-槍蛋白(P-gp)，多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)，肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等，酶介導(dǎo)的耐藥，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo)，谷朧甘膚(GSH)及谷朧甘膚-S-轉(zhuǎn)移晦(GST),蛋白激酶C(PKC)，脫氧胞喻健核普激酶(deoxycytidinekinase)等;凋亡墓因介導(dǎo)的耐藥[“〕，如bcl-2家族，p53墓因，c-myc等。多藥耐藥(MDR)是多因素，多種機制共同作用的結(jié)果。real-time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是了解腫瘤耐藥，指導(dǎo)臨床治療策略的有用手段，它能觀測用藥前后及復(fù)發(fā)時腫瘤細胞的耐藥墓因mRNA表達變化，從而及時調(diào)整治療方案和評價疾病的預(yù)后。

2.4病毒感染的定f監(jiān)測擴增技術(shù)的發(fā)展使得對病毒的定性或定t檢測的能力隨之提高，也使研究病毒的負(fù)荷和疾病進展的關(guān)系成為可能。Real-timeQ-PCR是主要被運用于科研和診斷領(lǐng)域的擴增技術(shù)，它不僅能對病毒定性，而且由于其實驗的批間和批內(nèi)差異小，重復(fù)性好，因此能方便、快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是從中可以動態(tài)地研究在整個病程中潛在病毒的復(fù)活或持續(xù)，從而使臨床醫(yī)生和病毒學(xué)家能檢測臨床的變化，如抗病毒治療的效果，耐藥變異的出現(xiàn)等。目前運用較多的是在器官移植中對使用免疫抑制劑的病人用Real-timeQ-PCR來定量測定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病人中用Real-timeQ-PCR檢測CMV感染比傳統(tǒng)的pp65抗原試驗更敏感，抗CMV藥物治療能使血中的病毒含量下降，Real-timeQ-PCR對于快速定量骨移植病人的CMV感染和監(jiān)測CMV復(fù)活是一個有用的工具。

3存在的問題及應(yīng)用前景

在real-time令PCR技術(shù)中，無論是相對定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有侍解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個必不可少的過程。目前由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致使實驗結(jié)果缺乏可比性。此外，用:eal-timeqPCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。另外，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，Real-timeQ-PCR的不足之處是[18]:(1)由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大小;(2)因為熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了real-timeQ-PCR的復(fù)合式multiplex)檢測的應(yīng)用能力;(3)目前real-timeQ-PCR實驗成本比較高，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)不斷改進和發(fā)展，目前real-timeQPCR已成為科研的主要工具，該技術(shù)未來的應(yīng)用前景是令人鼓舞的，一方面real-timeQ-PCR技術(shù)與其它分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數(shù)成為可能。另一方面熒光標(biāo)記核酸化學(xué)技術(shù)和寡核普酸探針雜交技術(shù)的發(fā)展以及real-time技術(shù)的應(yīng)用，使定量PCR技術(shù)有一個足夠的基礎(chǔ)為廣大臨床診斷實驗室所接受，將有助于臨床醫(yī)生對疾病的診斷和治

療。

4結(jié)語

Real-timeqPCR的發(fā)展使得研究人員又多了一種比較簡單且自動化的手段去研究許多重要的基礎(chǔ)課題。雖然此技術(shù)仍存在一些不足需要改進，但是它為real-timeQ-PCR在常規(guī)診斷檢測中的運用打下了良好的基礎(chǔ)oReal-timeQ-PCR將成為未來分子生物學(xué)實驗室必備的研究工具。