單克隆抗體制備標(biāo)準(zhǔn)化操作方案(McAb-sop)

 第一章:  小鼠免疫

 第二章:  細(xì)胞融合

 第三章:  細(xì)胞建株

 第四章:  細(xì)胞株鑒定

 第五章:  腹水制備

 第六章:  抗體純化和鑒定（略）

第一章.                      小鼠免疫(BALB/c)

   小鼠免疫是單抗制備的關(guān)鍵一環(huán),質(zhì)控小鼠免疫是制備優(yōu)質(zhì)單抗的唯一保證。

一.小鼠免疫分兩程方案:根據(jù)免疫學(xué)原理小鼠免疫方案設(shè)計(jì)如下:

1.短程免疫方案:

   第一次:   1d   100ug(可溶性Ag)+等體積完全佐劑.   腹腔注射. 0.4ml/只

   第二次:   7d   100ug+等體積不完全佐劑           腹腔注射. 0.4ml/只

   第三次:   12d   50ug                                 IV   0.3ml/只

(強(qiáng)化)第四次: 15d   20ug                                 IV   0.3ml/只

     第17 d~24d內(nèi)融合

     2長(zhǎng)程免疫方案:

   第一次:   1d    100ug+等體積完全佐劑           腹腔注射(IP)0.4ml/只

   第二次:  14d    100ug+等體積不完全佐劑           IP      0.4ml/只

   第三次:  21d    100ug                            IP或IV 0.4ml/只                      

   第四次:  25d     50ug                              IV    0.3ml/只

(強(qiáng)化)第五次: 28d    20ug                              IV    0.3ml/只

 第30d~37d內(nèi)融合.

 注意:a.在融合前(即加強(qiáng)免疫前)必須測(cè)定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必須≥1:8000,長(zhǎng)程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周內(nèi)做完融合. 否則不能保證融合質(zhì)量。                                                                             二． 小鼠免疫質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

1．免疫鼠血清滴度   短程≥1：8000，長(zhǎng)程≥1：32000；                   

2．小鼠免疫后需在一周內(nèi)做完融合；

3．免疫鼠脾臟明顯大于空白鼠脾臟并且較粘連。

免疫鼠選擇：免疫種類(lèi)為:baleb/c小鼠；性別.雌性佳：大�。�6-7周齡：體重：20g;

健壯.活潑。

                     第二章．細(xì)胞融合

一．  融合前準(zhǔn)備

1．  脾細(xì)胞：取符合免疫質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的鼠在無(wú)菌條件下取出其脾臟，并制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，每只鼠的脾細(xì)胞約1～3億。在制備過(guò)程中嚴(yán)格保證無(wú)菌。制備脾細(xì)胞可選擇研磨器+篩網(wǎng)或用無(wú)菌注射器吹吸。

2．  SP2/0細(xì)胞準(zhǔn)備：SP2/0細(xì)胞在融合前4天腹蘇.并用8- Ag篩選兩次，隔天換液，在融合前一天換成普通培養(yǎng)基1640,10%小牛血清，SP2/0細(xì)胞數(shù)量在2000萬(wàn)～3500萬(wàn)為宜，細(xì)胞處于分裂期較佳，衰老細(xì)胞不宜使用。

3．  PEG1450準(zhǔn)備：取PEG1450干粉高壓后加入等體積 PBS在60℃溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450.

4．  HAT培養(yǎng)基準(zhǔn)備：根據(jù)鋪板數(shù)量準(zhǔn)備，20%小牛血清的HAT1640培養(yǎng)基.20ml/塊板。

5．  終止液15-20ml:不含 Hepes的1640培養(yǎng)基或PBS（PH7.4）

二. 融合:

制備脾細(xì)胞懸液并用PBS(PH9.4)洗滌干凈后混入SP2/0細(xì)胞按脾細(xì)胞比SP2/0=10:1～5:2混合并離心,1200rpm×５min 離心后滴干混合細(xì)胞.輕敲彈松細(xì)胞團(tuán)塊。在37℃水浴中加入PEG1450  0.8ml在50秒內(nèi)加完　不宜吹打，加完后在37℃水浴中反應(yīng)2min后加入終止液在 5min內(nèi)加完15～20ml,加終止液時(shí)應(yīng)沿管壁緩慢加入.動(dòng)作應(yīng)輕柔.不宜吹打以免使剛?cè)诤系募?xì)胞分離。

三. 融合后加樣:

融合細(xì)胞終止后于900rpm×8min離心，并吸干以防殘留PEG。離心后把融合細(xì)胞轉(zhuǎn)入HAT培養(yǎng)基，并滴板200ul/孔，全過(guò)程應(yīng)防止吹散融合細(xì)胞。

四. 換液:

待融合細(xì)胞在HAT中培養(yǎng)7天左右后（即未融合的SP2/0和脾細(xì)胞死后）換成HT培養(yǎng)基。200ul/孔 第8～10天檢測(cè)。

                  第三章．細(xì)胞建株

 一.融合板檢測(cè)：

       待融合板換液細(xì)胞長(zhǎng)至中等大小約1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上開(kāi)始檢測(cè)（檢測(cè)方法參見(jiàn)附表ELISA方法）在ELISA質(zhì)控合格（即陰性對(duì)照<1.0，陽(yáng)性對(duì)照>1.0）后挑選陽(yáng)性孔（一般OD450≥0.5）作亞克隆。

 二.亞克隆方法及檢測(cè):

      挑出融合板陽(yáng)性孔全部細(xì)胞加入8-10ml HT培養(yǎng)基，混均鋪板4-6縱行；待亞克隆生長(zhǎng)5-7天，克隆長(zhǎng)大（約1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上/孔），即可檢測(cè)（用 ELISA方法）。

三.單克隆鋪板和檢測(cè):

     挑取亞克隆檢測(cè)陽(yáng)性值高的孔計(jì)數(shù)作有限稀釋4:2:1:0.5個(gè)細(xì)胞四個(gè)梯度鋪板1個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞株/塊。待單克隆生長(zhǎng)7-10天，單克隆細(xì)胞長(zhǎng)至中等大�。�1萬(wàn)/孔）時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其中單克隆細(xì)胞≥8個(gè)/株（一般檢測(cè)12個(gè)孔），待檢測(cè)單克隆全陽(yáng)后再進(jìn)行一次同樣的單克隆。

四．細(xì)胞株確立：

      待兩次單克隆檢測(cè)全陽(yáng)后挑出三孔/株，作擴(kuò)大培養(yǎng)于24孔板；24孔板細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后作交叉Ag鑒定和穩(wěn)定性鑒定（即再次測(cè)其培養(yǎng)上清看是否還能分泌單抗）鑒定合格后選擇其中一株長(zhǎng)勢(shì)好.OD450箱高的擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)胞瓶，并進(jìn)行凍存，5支/株，≥200萬(wàn)/支細(xì)胞。

                   第四章．細(xì)胞株鑒定

   在細(xì)胞株凍存完畢后必須復(fù)蘇同一批次中的一支進(jìn)行鑒定。

鑒定標(biāo)準(zhǔn)：1.復(fù)蘇活細(xì)胞數(shù)≥100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/支；

            2.活細(xì)胞中有活力細(xì)胞≥50萬(wàn)/株;

            3.復(fù)蘇細(xì)胞中不能有除細(xì)胞株細(xì)胞以外的其它微生物(如:細(xì)           菌.真菌.支原體等)出現(xiàn).

            4.復(fù)蘇細(xì)胞生長(zhǎng)到一定數(shù)目后選出生長(zhǎng)好的細(xì)胞作單克隆計(jì) 數(shù)鋪板.并檢測(cè)單克隆的分泌抗體能力是否是否全陽(yáng)或有抗體分泌.

            5.細(xì)胞培養(yǎng)上清也需作ELISA確定是否分泌抗體同時(shí)作交叉抗原復(fù)查,及 western-boltting鑒定是否為單抗。

  第五章．腹水制備及細(xì)胞株擴(kuò)增

腹水制備：在細(xì)胞株鑒定合格后收集培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，打小鼠腹水方法如下：

1. 小鼠選擇：10周齡  baleb/c雌性小鼠，小鼠毛發(fā)油光，活潑約30克體重。

2. 打腹水前小鼠準(zhǔn)備：選優(yōu)鼠在打腹水前，7—30天內(nèi)致敏小鼠選石蠟油（或其它礦物油）0.5ml/只IP(腹腔)注射。

3. 打腹水：收集合格雜交瘤細(xì)胞加于PBS（PH值7.4）或生理鹽水(無(wú)菌)中,200萬(wàn)-500萬(wàn)/只鼠。IP

4. 腹水收集：雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔后5-7天即可產(chǎn)生腹水。（小鼠狀態(tài)：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思飲）此時(shí)可用無(wú)菌注射器抽取約2-5ml/只。腹水特點(diǎn)：血性或乳白色或微黃、脂性、略濃。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可處死。）