多路復(fù)用蛋白質(zhì)分析技術(shù)最近研制成功，主要包括兩種子技術(shù)：平板芯片和球形芯片。

平板芯片：該技術(shù)采用一塊二維微芯片，芯片內(nèi)含針對各種分析所定義的反應(yīng)位點(diǎn)。通過可溶階段的配合基，平板芯片可以對蛋白質(zhì)、代謝物及其他分子組成的混合物中的幾種固定化蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測。

幾年前，某研究小組制造了一種內(nèi)置1152個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的自身抗原芯片。這種平板芯片采用聚左旋賴氨酸包被的玻璃載玻片作為固體載體。將196種不同的假定自身抗原以4個(gè)或8個(gè)復(fù)制組的形式進(jìn)行點(diǎn)樣，由此產(chǎn)生有序陣列。結(jié)合在固體基質(zhì)上的蛋白質(zhì)包括36種重組或純化蛋白質(zhì)、6種核酸抗原以及154種重疊和免疫顯性合成肽，這些肽來自于核內(nèi)小分子核糖核蛋白、Sm抗原蛋白、多聚（二磷酸腺苷-核糖）聚合酶以及H1、H2A、H3和H4組蛋白。在芯片內(nèi)可進(jìn)行針對磷酸化激活修飾蛋白的抗體試驗(yàn)。通常以熒光素Cy3標(biāo)記的羊抗人IgG作為芯片試驗(yàn)的標(biāo)記物。

試驗(yàn)可以檢測出納克/毫升濃度水平的抗體，而且線性范圍達(dá)三個(gè)對數(shù)。分析靈敏度一般高于酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)。

此項(xiàng)研究所暴露出的一個(gè)技術(shù)問題是，幾種Sm抗原和組蛋白因點(diǎn)樣技術(shù)被滅活了。據(jù)推測，蛋白與固體表面的結(jié)合是抗原表位丟失的原因。研究人員表示，或許可以通過優(yōu)化結(jié)合化學(xué)性質(zhì)或者改進(jìn)表面包被技術(shù)來糾正這一問題。此外，一些結(jié)合在載玻片上的抗原還受到蒸發(fā)速度過快的不利影響。

另一組研究人員也進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn)，他們把14種自身抗原復(fù)本以及空白對照和校準(zhǔn)品點(diǎn)樣在聚苯乙烯孔中（圖1），然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG與可激活的化學(xué)發(fā)光底物同時(shí)使用，并且通過以電荷耦合器件（CCD）攝像機(jī)為基礎(chǔ)的芯片檢測儀記錄到了光信號(hào)。通過人IgG校準(zhǔn)品進(jìn)行抗體定量。該技術(shù)將最常用的臨床試驗(yàn)整合在一塊簡單的微型芯片上。就分析結(jié)果而言，這種塑料芯片與商用分析試劑盒不相上下。

作為臨床試驗(yàn)室和生物醫(yī)學(xué)研究的專用自動(dòng)化平臺(tái)，Randox Evidence采用了蛋白質(zhì)生物芯片技術(shù)，通過CCD攝像機(jī)對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)射光進(jìn)行探測。

球形芯片：多路復(fù)用蛋白質(zhì)分析技術(shù)的第二種子技術(shù)采用了一種微球裝置懸浮液，每個(gè)裝置代表了一種不同的分析試驗(yàn)。該系統(tǒng)有時(shí)被稱為液體芯片。通過熒光染料對這種微球（直徑約5微米的塑料小球）進(jìn)行內(nèi)部編碼，并分別用于多路復(fù)用分析的具體試驗(yàn)。通過流式熒光分光光度法對小球進(jìn)行檢測。

對微球懸浮液進(jìn)行自身免疫多路復(fù)用分析通常采用Luminex公司（美國德州，Austin）開發(fā)的技術(shù)。通過該公司的xMAP技術(shù)，經(jīng)熒光團(tuán)編碼的微球在不同的分析中起到條形碼的作用。⁶　每個(gè)小球裝置可以通過具有不同生物測定特異性的試劑進(jìn)行包被，分析物由小球裝置中的不同紅光和近紅外線熒光染料濃度確定。這樣就可以對樣品中的特定分析物進(jìn)行捕捉和檢測（圖2）。分析儀通過一道激光束激活小球的內(nèi)部染料（這種染料將微球分為不同類別），而另一道激光則激活報(bào)告染料（通常是B-藻紅蛋白），測定過程中該激發(fā)光將被捕捉。各小球裝置可以獲得幾十個(gè)到幾百個(gè)讀數(shù)。

Luminex 100流式設(shè)備通過數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)按照預(yù)先設(shè)定的分布區(qū)域?qū)Ω鱾�(gè)微球進(jìn)行分類。每個(gè)微球表面都含有多個(gè)羧基，這些羧基可以作為蛋白質(zhì)共價(jià)連接的位點(diǎn)。通過一系列校準(zhǔn)品對小球表面的報(bào)告染料進(jìn)行定量測定。

微球具有較小的體積和較大的表面積，比平面固相芯片具有更好的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性能。而且，微球在懸浮液中的流動(dòng)性也優(yōu)于靜態(tài)平板芯片。將樣品均勻分布到所有平板芯片區(qū)域極為關(guān)鍵，但是對于懸浮芯片這一點(diǎn)卻無關(guān)緊要。

目前已有多篇利用Luminex技術(shù)進(jìn)行自身免疫研究的研究報(bào)道。其中一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)檢測了5種可提取性核自身抗原，與公認(rèn)的單一試驗(yàn)ELISA法相比具有良好的相關(guān)性。另一個(gè)小組研究了37名干燥綜合癥患者血清中的抗核抗原(ANAs)和可提取性核抗原。他們分別在84%和76%的患者血清中檢測到干燥綜合癥A抗原和B抗原(SSA和SSB)的抗體。

Bio-Rad　Laboratories公司(美國加州，Hercules)的BioPlex 2200 ANA篩查儀是一種以Luminex為基礎(chǔ)的全自動(dòng)系統(tǒng)，可以同時(shí)測定13種自身免疫抗體的水平。一項(xiàng)臨床研究表明，這種ANA篩查儀的特異性與ELISA ANA篩查試驗(yàn)不相上下�！∨cELISA試驗(yàn)相似，該BioPlex系統(tǒng)的陽性率低于用于自身抗體篩查的間接免疫熒光試驗(yàn)。

優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：這兩種多路復(fù)用技術(shù)（懸浮和平板芯片）各有優(yōu)缺。二維微芯片技術(shù)在蛋白質(zhì)或核酸的高密度篩查（包括100多種的試驗(yàn)）方面非常出色。平板芯片尤其適用于單一試驗(yàn)中對從細(xì)菌到人的各種生物體的整個(gè)基因組或蛋白質(zhì)組進(jìn)行同時(shí)分析。微球芯片在臨床試驗(yàn)室中的優(yōu)勢尤為突出，這些試驗(yàn)中的檢測分析物都是精心設(shè)定而且通過較小的面板進(jìn)行測定。

微芯片技術(shù)有時(shí)缺乏高通量臨床應(yīng)用所必需的重復(fù)性。這主要是因?yàn)槠桨逍酒�的制備需要序列化的生產(chǎn)過程。相反，微球芯片的大量生產(chǎn)具有平板芯片不易達(dá)到的分析重復(fù)性。

此外，平板芯片的超靜定性和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水平也不如微球芯片。這是因?yàn)槊總�(gè)測定裝置在一次多路復(fù)用小球反應(yīng)中通常會(huì)檢測數(shù)百個(gè)微球，每個(gè)小球代表一種不同的免疫測定，而且在計(jì)算結(jié)果前即可將數(shù)據(jù)集中的異常值排除在外。

懸浮芯片有助于根據(jù)客戶要求將配合基與每個(gè)小球裝置進(jìn)行偶合。結(jié)合在不同小球裝置上的配合基可以在不同結(jié)合化學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。每種配合基的純度可能各不相同，例如有的像細(xì)胞裂解液一樣，而有的像重組蛋白一樣。每個(gè)小球裝置與配合基之間可以使用不同的接頭。最后，在每個(gè)小球裝置制造時(shí)可以采用不同的包被后或封閉步驟。

微球芯片具有顯著的優(yōu)勢：每個(gè)微球裝置均以最佳方式單獨(dú)加工，隨后將不同的小球裝置組合起來制備最終的多路復(fù)用小球試劑。

芯片檢測中可以容納大量的分析物，因此可以使用多個(gè)內(nèi)部對照以確保測定系統(tǒng)的預(yù)期性能。自身抗體的多路復(fù)用分析中可能需要不同的對照（表II）。