影響ELISA試驗效果常見問題原因分析及解決辦法

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ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在科研上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。 
下面將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下： 
操作步驟： 


目錄
[隱藏]
1 選擇試劑： 
2 標(biāo)本收集與保存： 
3 試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項： 
4 加 樣： 
5 溫 育： 
6 洗 板： 
7 顯 色： 
8 終 止： 
9 讀 板： 
10 全過程： 
11 ELISA實驗的結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)分析


選擇試劑： 
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。 
參考準(zhǔn)備ELISA實驗的正確步驟#ELISA實驗的事前準(zhǔn)備工作一 
標(biāo)本收集與保存： 
避免使用肉眼可見的溶血標(biāo)本、高脂標(biāo)本和混濁標(biāo)本； 
2-8℃下，標(biāo)本可放置24-48小時，長期保存需放置-20℃下。 
請避免反復(fù)凍融。 
具體請參照： 
ELISA實驗標(biāo)本的采集與處理： 
ELISA實驗標(biāo)本的保存： 
試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項： 
試劑盒中會有提示，一般需要準(zhǔn)備的有： 
洗滌液；用前配制；有的試劑盒會標(biāo)明，配好的4度下一般可以放一個月；如果沒有標(biāo)明，盡量用新鮮的，不要多配制。 
顯色液（有A液和B液的），用前15分鐘配制； 
標(biāo)準(zhǔn)品：有的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)配制好的，4度保存；有的是要現(xiàn)配制的；按照說明書操作； 
濃縮生物素結(jié)合的二抗和HRP：如果需要配制，試劑盒沒注明配好可以保存多久的話，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用（用前15分鐘配制）； 
原則是： 
試劑盒上沒有指出配制物的儲藏方式的話，應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用；不要怕麻煩； 
還有，小瓶的管子開蓋前要離心，以免蓋子上粘連以後總量不夠。 
加 樣：
室溫溫育的試劑，特別是溫育時間比較短的實驗操作的試劑，加樣對數(shù)據(jù)的影響比較大。特別要注意加樣問題。 
不好的操作原因： 
不會正確使用加樣器； 
血清或血漿標(biāo)本分離不好即進行加樣； 
手工操作中，加樣板過多造成加樣後放入孵箱前等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時)； 
加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外； 


解決辦法： 
熟悉加樣器的使用，在進行實驗之前用水來練習(xí)加樣的快速和準(zhǔn)確； 
試驗前標(biāo)本需緩慢升溫至室溫，若標(biāo)本為血清，凍結(jié)血清融解後，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清後再檢測； 
加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出； 
加樣後及時放入孵箱； 
加酶試劑後用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干； 
如果采用AT或其他全自動加樣，最好選擇FAME或其他後處理儀器加酶試劑； 
標(biāo)本較多時，請分批操作。每次加樣最好在兩到三分鐘內(nèi)完成。加標(biāo)本時最好三排一加。每次加完樣進行計時； 

參考ELISA#加樣 
溫 育： 
不好的操作原因： 
溫育時未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底； 
溫育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。 
解決辦法： 
貼封片或加蓋：為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜復(fù)蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 
按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間。 
建議采用空氣浴進行溫育。 
參考ELISA實驗操作中的溫育(incubation) 
洗 板： 
結(jié)果不好的可能原因 
采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。 
采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不徹底；洗板針堵塞，抽吸不完全；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。 
反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。 
在間接法中如本底較高。 


在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，操作時尤為注意： 
保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後最好在吸水紙或毛巾（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干（若使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。）； 
注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率最好在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解後配制。 
保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。 
合理安排，或多用幾臺洗板機。 
在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。 
參考ELISA#洗滌 
顯 色： 
結(jié)果不好的可能原因 
顯色劑配制後放置時間過長或使用過期顯色劑； 
加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。 
解決方法： 
顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用； 
加樣時保持顯色劑不外流，且加樣量要準(zhǔn)確，順序不能顛倒。 
A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。 
可以參考ELISA#顯色和比色 
終 止： 
結(jié)果不好的可能原因： 
加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。 


解決方法： 
加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，及時終止顯色。 
讀 板： 
結(jié)果不好的可能原因： 
讀板時板底底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面。 
應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。 
此外酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 
全過程： 
整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸; 
實現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化，有效提高檢測質(zhì)量。 

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。在實際操作中必須嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本，才能保證試驗效果。 


ELISA實驗的結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)分析 
請參考試劑盒的說明書。 
示例： 
某定量試劑盒：