PCR常見問題
PCR產物的電泳檢測時間
一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶�！ �
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數。
克隆PCR產物的最優(yōu)條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。
PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T�？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。
對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4oC過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產生缺失和重排，如發(fā)現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞
一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶�！ �
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高�！ �
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽 性。需重新設計引物�！ �
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴 增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高�！ �
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽 性。需重新設計引物�！ �
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴 增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數。
克隆PCR產物的最優(yōu)條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。
PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T�？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。
對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4oC過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產生缺失和重排，如發(fā)現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞
標簽：
PCR
