RNA干擾(RNA interference，RNAi)是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)同源mRNA 降解的現(xiàn)象。RNAi現(xiàn)象先后在不同生物中被發(fā)現(xiàn)，植物學(xué)家稱它為共抑制(co-suppression)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)；線蟲(chóng)和果蠅的研究人員稱它為RNAi；真菌的研究者稱它為消除作用(quelling)�，F(xiàn)在人們己經(jīng)意識(shí)到RNAi現(xiàn)象在生物體中普遍存在，而且可能有著共同的生物學(xué)意義和相似的作用機(jī)制。

 

 

1990年，在轉(zhuǎn)基因植物牽牛花( Petunias)的研究中發(fā)現(xiàn)，將色素合成基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后，導(dǎo)入牽�；ㄖ�，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié)果是不僅轉(zhuǎn)入的基因未表達(dá)，而且自身色素合成也減弱了。當(dāng)時(shí)將這種現(xiàn)象稱為PTGS或“共抑制”(cosuppression)。Ramamor N等在粗糙脈孢菌中導(dǎo)入合成胡蘿卜素基因后，約30%的被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中自身合成胡蘿卜素的基因失活，他們稱為基因靜止(quelling)�？的藸柎髮W(xué)的Guo S 等用反義RNA 技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)中parl 基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)正義RNA 和反義RNA 均能阻抑基因功能表達(dá)，而且兩者的作用是相互獨(dú)立的，機(jī)制各異。華盛頓卡耐基研究院的Fire A 等首次在秀麗新小桿線蟲(chóng)中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾，于2006年榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在1999年短短的一年間，發(fā)現(xiàn)RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、蛙類、鳥(niǎo)類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNAi現(xiàn)象。

 

 

Hamilton等和Ketting等分別在發(fā)生共抑制的煙草和西紅柿中鑒定了一些大約25 個(gè)堿基大小的與沉默基因的正義鏈和反義鏈互補(bǔ)的RNA。Zamore 等在果蠅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)被注射進(jìn)入的雙鏈RNA被切割為21～23 堿基長(zhǎng)短的雙鏈RNA片段。他們認(rèn)為這些siRNA 在RNAi 過(guò)程中起著重要作用。這些siRNA一般為長(zhǎng)21～23 個(gè)堿基對(duì)的雙鏈 3’端具有2個(gè)突出的堿基，多為尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羥基；5’端被磷酸化。這些特點(diǎn)可能是其與別的RNA 相區(qū)別，能被特異地識(shí)別，而這一特點(diǎn)也是RNase III 酶切后的特征。研究表明mRNA 被特異性切割發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中當(dāng)雙鏈RNA 進(jìn)入細(xì)胞后，能與類似RNase III 的Dicer 結(jié)合，隨即被切割成21～23個(gè)堿基的siRNA。siRNA與RISC( RNA induced silencing complex) 結(jié)合，若雙鏈5’端未被磷酸化，則會(huì)啟動(dòng)其磷酸激酶活性，將其磷酸化并被解螺旋。反義鏈RNA 與RISC 結(jié)合后將其內(nèi)切酶活性激活，激活的RISC 在細(xì)胞質(zhì)中尋找能與反義RNA 同源的mRNA，并在雙鏈的中心部位、距雙鏈RNA 5’端第10 個(gè)堿基處將其切割，從而使mRNA 降解。Sijen等認(rèn)為雙鏈RNA 在RNAi 初期的作用是為RdRP ( RNAdependent RNA Polymerase ) 提供引物，并以靶mRNA 為模板合成更多的雙鏈RNA。這一假設(shè)在其它物種中得到證實(shí)。

目前人們已經(jīng)在線蟲(chóng)、果蠅、擬南芥及脈胞菌等物種中鑒定了多個(gè)與RNAi 過(guò)程相關(guān)的基因，如線蟲(chóng)基因ego - 1，rde - 1和rde - 4，脈胞菌的qde -2，擬南芥的ago1基因等。RNAi 在生物體的進(jìn)化與發(fā)育過(guò)程中具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦�。AGO1，QDE2和RDE1在植物的轉(zhuǎn)基因沉默、真菌的壓抑現(xiàn)象和動(dòng)物的RNAi中起著相似的作用。Boutla等從產(chǎn)生基因沉默的植物中提取RNA，在注射到線蟲(chóng)后引起了特異基因的沉默。但不同物種間在RNAi 上仍有較大的差異。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用21個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA 可以引起特異的抑制反應(yīng)，而較長(zhǎng)的雙鏈RNA (超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)) 轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞會(huì)引起非特異的基因抑制。長(zhǎng)的雙鏈RNA 激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通過(guò)一系列的磷酸化使翻譯起始因子eIFa失活，導(dǎo)致翻譯抑制或者長(zhǎng)dsRNAs激活RNase L，導(dǎo)致非特異的RNA 降解。

 

 

進(jìn)行RNAi首先要進(jìn)行的是目的基因的選擇，在目前所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中一般選擇對(duì)應(yīng)于能被容易檢測(cè)的表型的目的序列。自從發(fā)現(xiàn)使用cDNA模板RNAi突變擬表型的外顯率比使用基因組模板高后，cDNA序列成為指定的模板。然而，在沒(méi)有cDNA的情況下，也可以使用富含外顯子的基因組序列。RNAi效率可能受所用dsRNA長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)類似物等其他因素的影響。傳遞dsRNA的方法也可能影響RNAi反應(yīng)的強(qiáng)度。在C.elegan中傳遞RNA最普遍的方法是對(duì)微生物多核體、體腔或內(nèi)臟進(jìn)行微注射。在C.elegan中對(duì)成年蠕蟲(chóng)進(jìn)行微注射被認(rèn)為是最有效的RNAi途徑。雖然其他傳遞RNA的方法強(qiáng)度較小，但是dsRNA浸泡、給蠕蟲(chóng)喂養(yǎng)表明C.elegan dsRNA的E.coli方法已經(jīng)被用來(lái)進(jìn)行整個(gè)基因組功能分析和高通量篩選。

 

 

雖然RNAi的作用機(jī)制還有很多未搞清楚，但是有很多的分子生物學(xué)家認(rèn)為RNAi 是研究功能基因組的一個(gè)非常有用的工具。因?yàn)镽NAi已被用來(lái)研究并搞清楚了包括果蠅、線蟲(chóng)和一些植物的基因的功能。最近研究者甚至找到了更便利的方法，即通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源的RNA 發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的表達(dá)，誘導(dǎo)穩(wěn)定的具有序列特異性的的沉默現(xiàn)象，從而可以建立持續(xù)缺失某種功能表型的細(xì)胞系，為生化分析提供大量的沉默細(xì)胞，同時(shí)，對(duì)某種表型進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察評(píng)價(jià)也成為可能。預(yù)計(jì)不久的將來(lái)，很多類型的培養(yǎng)細(xì)胞都能生長(zhǎng)在“RNAi 芯片”——siRNA 的點(diǎn)陣的上面，可以記錄基因組中每個(gè)基因被抑制表達(dá)以后的表型，以及多個(gè)基因被漸次抑制后的綜合表型，從而可以知曉基因的功能及他們之間的相互作用�？傊�，RNAi 將在后基因組時(shí)代為解決疾病機(jī)理和鑒定候選藥物靶向的關(guān)鍵問(wèn)題——基因功能鑒定中發(fā)揮其簡(jiǎn)捷高效的特點(diǎn)而為人類服務(wù)。

為了研究胚胎在早期發(fā)育過(guò)程中的事件，通常人們想的是去除特定基因的表達(dá)，如果能在特定的時(shí)間里把胚胎細(xì)胞中的人們感興趣的基因的功能去除后人們將會(huì)得到很有價(jià)值的信息。

當(dāng)Dicer的同系物SIN1/ CARPEL FACTORY 發(fā)生突變時(shí)，動(dòng)物個(gè)體將發(fā)生嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，表明RNAi 路徑在某種意義上能夠調(diào)控與發(fā)育有關(guān)的基因的表達(dá)。最近的資料表明，在生產(chǎn)單短暫RNA(single temporary RNA，stRNA)時(shí)需要Dicer，stRNA 可以抑制靶mRNA 的翻譯，同時(shí)包含PAZ和PIPW結(jié)構(gòu)域的PPD 蛋白在干細(xì)胞、卵子發(fā)生、組織分化發(fā)育中都起著重要的作用。以上資料表明，Dicer及其同系物在動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中確實(shí)比較關(guān)鍵。一個(gè)受精卵或動(dòng)物的體細(xì)胞中具有相同的基因信息，所以能分化成各種不同類型的細(xì)胞，是由于不同基因表達(dá)的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)表明，Dicer 這個(gè)基因組的支配者和護(hù)衛(wèi)者，存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中，核移植生產(chǎn)克隆動(dòng)物要移去一部分的細(xì)胞質(zhì)，也就是說(shuō)要移去一部分的Dicer和mRNA，那么這個(gè)步驟是否影響供體核的基因的重編程，Dicer在體細(xì)胞克隆動(dòng)物的最初發(fā)育調(diào)控過(guò)渡：由體細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄后沉默到合子核轉(zhuǎn)錄活性的出現(xiàn)這一過(guò)程中，究竟起著怎樣的作用尚待研究。另外RNAi 作用中的組成成分和印記基因，以及X 染色體失活的關(guān)系如何，都是非常吸引人的研究課題。

RNAi的靶位識(shí)別是一個(gè)有著高度序列特異性的過(guò)程。由siRNA 到靶鏈，互補(bǔ)的靶位識(shí)別具有專一性，3′端突出中的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸影響靶mRNA 的裂解，一旦錯(cuò)配，將會(huì)使RNAi 的作用降低2～4 倍，指導(dǎo)性siRNA 的5′端和3′相對(duì)而言，對(duì)錯(cuò)配也有一定的允許性，但是與靶RNA 的斷裂位點(diǎn)相對(duì)的siRNA 中央的核苷酸是決定特異性非常重要的因素，即便有一個(gè)核苷酸改變，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中就不能檢測(cè)到RNAi 現(xiàn)象，說(shuō)明siRNA 雙鏈能夠辨別基因靶位時(shí)的突變或多態(tài)性等位基因(polymorphic alleles)，對(duì)將來(lái)的治療發(fā)展非常有利�，F(xiàn)在還不知道以RNAi 機(jī)制抵抗病毒或者動(dòng)物病毒基因編碼的蛋白對(duì)RNAi 是否起抑制作用，但了解RNAi 系統(tǒng)的作用機(jī)制，以及其與動(dòng)物病毒的相互作用是建立以RNAi為基礎(chǔ)的人類疾病基因治療中的重要一環(huán)。